Summary
At styre ekspansion af somatiske stamceller er en vigtig faktor hæmmer deres undersøgelse og anvendelse i terapi. Her beskrives et system til tidsmæssigt styre neurale stamceller ekspansion under udvikling og voksenliv, som kan anvendes til at øge antallet af neuroner, der genereres i musehjernen.
Abstract
Somatiske stamceller kan dele at generere yderligere stamceller (ekspansion) eller mere differentierede celletyper (differentiering), hvilket er af afgørende betydning for vævsdannelse under fosterudviklingen og væv homøostase i voksenalderen 1. I øjeblikket er en stor indsats investeret i retning styre skift af somatiske stamceller fra ekspansion til differentiering, fordi det menes at være grundlæggende for at udvikle nye strategier for regenerativ medicin 1,2. En stor udfordring i undersøgelsen og anvendelse af somatiske stamceller er, at deres ekspansion er blevet vist sig meget vanskeligt at kontrollere.
Her beskriver vi et system, der tillader regulering af neurale stam-/ progenitorceller (helt benævnt NSC) ekspansion i muse embryonale cortex eller den voksne hippocampus ved at manipulere ekspressionen af cdk4/cyclinD1 komplekset, en vigtig regulator af G1-fasen af cellecyklussen og somatiske stamceller differentiation 3,4. Specifikt er to forskellige fremgangsmåder beskrevet af hvilken cdk4/cyclinD1 komplekset er overudtrykt i NSC in vivo. Ved den første fremgangsmåde, er overekspression af cellecyklussen regulatorer opnået ved injektion af plasmider, der koder for cdk4/cyclinD1 i lumen af muse telencephalon efterfulgt af in utero elektroporering til at levere dem til NSC den laterale cortex, således udløser episomal ekspression af transgener 5-8. Ved den anden fremgangsmåde er meget koncentrerede HIV-afledte vira stereotaksisk injiceret i den tandede gyrus i den voksne mus hippocampus således udløser konstitutiv ekspression af cellecyklussen regulatorer efter integration af det virale konstruktion i genomet af inficerede celler 9. Begge tilgange, hvis grundlæggende principper blev allerede beskrevet af andre video-protokoller 10-14, blev her optimeret til i) at reducere vævsskade, ii) målrettede brede dele af meget specifikke hjerne regions, iii) opnåelse af et højt antal manipulerede celler inden for hver region, og iv) udløser høje ekspressionsniveauer af transgenerne i hver celle. Transient overekspression af transgenerne ved hjælp af de to metoder opnås ved forskellige midler dvs naturlige fortynding af elektroporerede plasmider på grund af celledeling eller tamoxifen administration i Cre-udtrykkende NSC inficeret med virus der bærer cdk4/cyclinD1 flankeret af loxP-sites, henholdsvis 9,15 .
Disse metoder giver en meget kraftfuld platform til akut og vævs-specifikt manipulere ekspressionen af et gen i musehjernen. Især, ved at manipulere ekspressionen af cdk4/cyclinD1 komplekset vores system tillader den tidsmæssige styring af NSC ekspansion og deres skift til differentiering, dermed i sidste ende at øge antallet af neuroner, der genereres i pattedyrhjernen. Vores tilgang kan være af afgørende betydning for grundforskning og brug af somatiske stamceller til behandlingaf det mammale centralnervesystem samtidig give en bedre forståelse af i) stamceller bidrag til vævsdannelse under udvikling, ii) væv homøostase i voksenalderen, iii) den rolle, som voksne neurogenese i kognitive funktioner, og måske, iv) bedre anvendelse af somatiske stamceller celler i modeller for neurodegenerative sygdomme.
Protocol
Indledende bemærkning
Kirurgi skal udføres af fuldt uddannede efterforskere efter godkendelse fra de lokale myndigheder for dyrevelfærd. Alle forholdsregler skal træffes for at minimere smerte og stress påført til dyret, inklusive dyb anæstesi, administration af postoperativ analgesi og for aktioner, der varede mere end 10 minutter, anvendelse af et øje smøremiddel for at forhindre cornea dehydrering og blindhed. Bedøvede mus skal holdes konstant varm ved 37 ° C, indtil fuld helbredelse og alle kirurgiske værktøj og opløsning skal være steril. Selv om anvendelsen af en biologisk hætte ikke er strengt nødvendigt, skal operatøren træffe alle rimelige forholdsregler for at minimere risikoen for at inficere dyret under operationen ved at bære en lab coat, maske og handsker. Ligeledes skal hvert skridt vedrørende produktion og anvendelse af vira tillades og skal udføres på S2 områder efter reglerne i de lokale myndigheder.Endelig skal en grundig rensning af alle værktøjer og overflader, der kunne have været i kontakt med virus udføres i henhold til godkendte desinfektion praksis (for HIV ved aftørring med 70% Et-OH og / eller autoklavering).
Del 1: Udvidelse af embryonale NSC
1. In utero elektroporering
- Efter kloning transgenerne (dvs. cdk4/cyclinD1) i pCMS-EGFP (Clontech) eller pDSV-mRFPnls vektorer 16, oprense plasmider under anvendelse EndoFree kit og resuspender i sterilt PBS til en koncentration på 3-5 pg / pl. Hurtigt før indgrebet, blandes plasmiderne med 0,05% FastGreen i PBS til et endeligt forhold på ca. 04:04:01 og centrifugeres blandingen i 2 minutter ved 16.000 x g for at fjerne alle præcipitater.
- Indlæse DNA blandingen i en tidligere trukket borsilikatglas kapillar. Trække parametre ved hjælp af en P-97 pipette aftrækker er: pull: 200; Vel: 140, tid: 140. Varme afgives af en rampe test og afhænger af specforsk masse kapillarer anvendes. Montere kapillarrøret på mundstykket af PicoPump, der er nær ved in utero elektroporation platform (figur 1A) og, under et stereomikroskop, spidsen og nick den ved vendepunktet bøje.
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer på et tørt glasperle sterilisator og dybt bedøver en gravid mus på dag 12-15 i drægtighedsperioden ved hjælp af en isofluran vaporizer. Placer dyret i liggende stilling på en opvarmning platform indstillet på 37 ° C og holdes under konstant isofluran administration gennem en næse kegle.
- Barbering af huden på maven, desinficeres med Betaisodona flere gange, eventuelt tørre i mellem med 70% ethanol, og injicere buprenorphin (fortyndet i PBS) subkutant ved 0,1 mg / kg koncentration som forebyggende analgetisk. Anvendelse af fine sakse, lave en 2 cm langsgående snit i huden og derefter det underliggende muskulære væg for at få adgang til bughulen. Dispensere i bughulen ca. 2ml IUE opløsning (D-PBS indeholdende 100 U / ml pen / strep) forvarmet ved 37 ° C og holde opløsningen på en varmeblok.
- Dække mus med sterilt drap indeholdende en revne hvorfra uteri bliver fjernet. Træk snittet ved hjælp af en wolfram retraktor, identificere livmoderen og træk det ud holde det med pincet mellem tilstødende embryoner (Figur 1B, venstre) og endelig lægge det ned på den sterile drap. Under hele operationen, skylles livmoderen med IUE opløsning til moisturize organ-og legemshulrum og forhindre dehydratisering af dyret.
- Håndter livmoderen forsigtigt holde den mellem tommel-og indeks, og drej ét embryon, indtil dens hoved er synlig og orienteret mod operatøren. Identificer de telencephalic halvkugle og indsprøjte en af dem fra den dorso-laterale side. Frigive 1-2 pi DNA-opløsning ved hjælp af fodkontakten af en PicoPump indtil ventriklen er skitseret af FastGreen (figur 1 B, højre).
- Når alle embryoer injiceres og elektroporeret ved at anbringe livmoderen tilbage i bughulen og lukke de muskulære vægge med en sutur streng suturering hver 3-4 mm. Knuderne skal sidde på musklen men ikke for stramt at tillade en lille hævelse af vævet. Luk til sidst den overliggende hud med metalclips. Desinficer huden med Betaisodona, skal du fjerne musen fra isofluran maske og overføre det i et hus bur når de er fuldt vågen. Overvåg inddrivelse af musen, indtil lokomotorisk adfærd er normal.
2. Behandling af samPLE
- En eller flere dage efter elektroporering, ofre musen, indsamle fostre og identificere dem korrekt elektroporeret under anvendelse af en fluorescerende stereomikroskop (figur 1D). Dissekere hjernerne på iskold PBS, og rette dem natten over i 4% PFA (paraformaldehyd i phosphatbuffer pH 7,4). Til sidst, kan BrdU indgives før aflivning i henhold til forskellige paradigmer for at undersøge cellecyklus kinetik og celleproliferation 3.
- Hjernerne behandles derefter til sektionering og immunfarvning for de forskellige markører af radial glia, basal progenitorer og neuroner (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc.) for at vurdere virkningen af de funktionelle transgener på målrettet NSC og deres afkom, der er identificeres ved ekspressionen af det co-elektroporerede reportergen.
Figur 1.In utero elektroporering. (A) Skematisk repræsentation af en in utero elektroporation platform. (B) tegninger, der viser positioneringen af gravide mus under kirurgi (til højre) og injektion af DNA / FastGreen blanding (blå) i telencephalic halvkugle af en museembryo (venstre). (C) Scheme viser anbringelsen af elektroderne i kontakt med de uterine vægge med anoden (+) ved siden af injektionsstedet (blå). Pile viser migreringen af DNA'et mod anoden. (D) Billede af et museembryo 24 timer efter elektroporering med GFP-plasmider på embryonisk dag 13.. Stiplet linje afgrænser den telencephalic halvkugle. Ordning i et modificeret fra Calegari et al., 2004 17.
Del 2: Udvidelse af Adult NSC
1. Produktion af HIV-afledte viruspartikler
- Dag 1: pladen 5 x 10 6 293T celler på en 10 cmskål med 8 ml D-MEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100 U / ml pen / strep (dyrkningsmedium). Brug 15 retter til en viral forberedelse og kultur natten over ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Dag 2: for hver skål, fortyndes i 1 ml almindelig D-MEM 5 ug af hver af tre plasmider der koder for i) VSVG (vesikulær stomatitis virus type G) kappeprotein, ii) gag / pol (gruppespecifikke antigen / polymerase) og iii) et polycistronisk konstruktion udtrykke de funktionelle og reporter transgener (dvs. cdk4/cyclinD1/GFP) tidligere klonede i en HIV-baseret transfervektor (p6NST90) 9. Blander denne opløsning med 1 ml D-MEM indeholdende 45 ul polyethylenimin, der er blevet opløst på forhånd i PBS ved 1 mg / ml stamopløsning, og inkuberes i 15-30 min ved stuetemperatur. I mellemtiden fjerne mediet fra cellerne, og der tilsættes 4 ml per skål frisk D-MEM indeholdende 15% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100 U / ml pen / strep. Tilsæt 2 ml transfektionsblandingen og kultur natten over.
- Dag 3: Tilsæt 120 pi af 500 mM Na-butyrat per skål til at forstærke ekspressionen af transgenerne, bland forsigtigt og kultur i 6-8 timer, hvorefter erstatte transfektion medium med 5 ml dyrkningsmedium.
- Dag 4: indsamle supernatanterne (ca. 70 ml i alt), passere gennem et 0,22 um filter og overførsel i 2 polyallomer centrifugerør (35 x 89 mm). Ultracentrifuge ved 110.000 x g i 90 minutter ved 4 ° C under anvendelse af en swing rotor. Supernatanten fjernes, der tilsættes 6 ml PBS til hvert rør og inkuberes på is i 1 time. Pellet resuspenderes og overføre det i en polyallomer centrifugeglas (14 x 95 mm). Ultracentrifuge ved 110.000 x g i 90 minutter ved 4 ° C under anvendelse af en swing rotor. Supernatanten fjernes, pellet resuspenderes i 50 pi PBS, gøre 5 ul portioner og opbevares ved -80 ° C. Virustiter vil være i området fra 10 8 -10 9 cfu / ml. (Bemærk: virus er meget følsomme over for temperatur og opbevaring, Avoid genfrysning, holde på tøris under transport og tø snart før brug.)
2. Stereotaktisk injektion
- Bedøve en 6-10 uger gamle mus med isofluran og dyret i liggende stilling på en stereotaktisk ramme (figur 2A) ved hjælp af øret barer og ganen til korrekt fastgøre hovedet. Dyret holdes varm på en varmepude indstillet ved 37 ° C og under konstant isofluran administration.
- Indsprøjtes subkutant 100 gl buprenorphin arbejder opløsning som forebyggende smertestillende, barbere en stribe af huden på hovedet af musen, og desinfect som beskrevet i 1,4. Ved hjælp af en skalpel, en ca gøre. 1,5 cm lang langsgående incision på hovedet huden udsætte kraniet på niveau med den sagittale sutur. Træk huden og forsigtigt rengøre knogleoverfladen med en steril vatpind.
- Half-fylde et glas kapillarrør (specifikationer i 1,2) med paraffinolie og montere den på injektoren pumpen indsættekapillarrøret indtil den anden ring (figur 2B). Flyt kapillære holderen i x, y og z aksen, indtil spidsen af kapillaret er placeret på bregma, at sammenholdt punkt mellem sagittale og laterale suturer (figur 2C) (skal bestemmes ved hjælp af et stereomikroskop), og reset-x, y-og z-værdier på 0.
- Flyt kapillar med ± 1,6 mm i den medio-laterale akse (x) og -1,9 mm i anterior-posterior akse (y), og afmærk knoglen ved hjælp af en kirurgisk tusch. Lave et hul på ca. 0,5 mm diameter på skallen ved hjælp af en elektrisk driller opmærksom på ikke at beskadige hjernen.
- Sætte en 5 pi dråbe af virussuspension (1 aliquot) på et stykke parafilm sættes på øret barer og immerge spidsen af kapillaret i dråben. Suck ca. 3,5 pi virussuspension med et nanoliter injektor på 55 nl / sek. Udføre dette trin hurtigt som dråben vil fordampe.
- Flyt kapillarrøret til stedet of indsprøjtning og flytte det ned, indtil spidsen rører pial overflade. Nulstil dorso-ventrale akse værdi (z) til 0. På dette tidspunkt trænger gennem vævet med kapillærrøret til -1,9 mm og frigive 1,5 pi virussuspension med en hastighed på 4 nl / sek. Vent i 2-3 minutter for at minimere tilbagestrømning af viral suspension gennem den kapillære bane, og derefter trække kapillarrøret. En anden injektion kan udføres i controlateral halvkugle.
- Sutur i huden, desinficere, og så dyret kan komme sig efter anæstesi som beskrevet tidligere for in utero elektroporation (1,8).
Figur 2. Stereotaktisk viral injektion. (A og B) Skematisk gengivelse af de komponenter, der kræves for at udføre stereotaktisk injektion (A) og en adskilt kapillær holder viser indsættelsen af et capillary indtil den anden ring (B). (C) billede af muse hovedet immobiliseret ved øret barer og ganen med huden skåret for at blotlægge kraniet (til venstre). Forstørrelsen af den punkterede kasse (højre) viser de laterale og sagittale sutur, til bregma og injektionsstedet (cirkel).
3. Behandling af prøven
- En-til-tre uger efter infektion, perfundere musen med ca. 100 ml 4% PFA, dissekere hjernen og post-ordne det natten over i 4% PFA. Til sidst kan BrdU og / eller tamoxifen indgives før aflivning efter forskellige paradigmer at undersøge cellecyklens kinetik og standse ekspressionen af de virale transgener flankeret af loxP-sites, henholdsvis 9.
- Hjernen kan derefter behandles til immunfarvning ved hjælp af adskillige markører for stamceller og stamceller og neuroner (f.eks Sox2, GFAP, nestin, Tbr2, doublecortin osv.).
Representative Results
- Samlet set in utero elektroporering giver 60-80% af elektroporerede embryoer udviser kraftig ekspression af reportergenet i et bredt område af den laterale cortex (figur 3A). Fluorescerende proteiner let kan afsløres på hele mount embryoer, så snart 3-6 timer efter operationen med signalet varet mere end en uge. Inden for det område, sædvanligvis ca 30-50% af celler udtrykker transgenet (erne) med andelen af celler co-ekspression af to (eller flere) co-elektroporerede transgener er sædvanligvis over 90% (figur 3B, venstre) 6,8 , 15. Mens et minimum af apoptose (ca. 2,0-2,5%) kunne observeres efter ca 2 timer fra elektroporering, vil denne værdi tilbage til fysiologiske niveauer (ca. 0,5-1,0%) efter omkring 6 timer (FC, ikke-publicerede data). Andelen af embryoner eller gravide mus dør på grund af operationen er typisk ubetydelig (<5%). Co-elektroporering med cdk4/cyclinD1 under disse betingelser efterfulgt af 48 timers udvikling udløser en stigning i vækst af neurale progenitor med 30% (figur 3B, højre, og C) 15.
Figur 3. Udvidelse af neurale progenitorer ved cdk4/cyclinD1 overekspression. (A) Fluorescence billede af et snit gennem den laterale cortex på en museembryo 24 timer efter elektroporering med GFP og RFP plasmider på embryonisk dag 13.. (B) Fluorescerende billeder som i et 48 timer efter co-elektroporering med cdk4/GFP og cyclinD1/RFP plasmider og immunolabeling for den basale progenitor markør Tbr2. Fluorescerende reportere med DAPI counterstainig (venstre) og Tbr2 (til højre) er vist. Linjer viser den apikale overflade af den ventrikulære zone (VZ, hvid linje) og grænserne for den subventricular zone (SVZ, gule stiplede linier). Bemærk den forøgede thickness af SVZ i den elektroporerede del af cortex (hvide pile) på grund af en øget produktion og udvidelse af basale progenitorer efter overekspression af cdk4/cyclinD1. (C) Kvantificering af virkningen der er vist i B. Bars = SD, p <0,05, n = 3. Søjlediagram i C er taget fra Lange et al. 2009 15.
- Efter viral stereotaktisk injektion, ca. 80% af opererede mus viser kraftig ekspression af transgenerne i hele tandede hjernevinding. Konstitutiv ekspression af GFP let kan afsløres på 40 um snit, så snart 4 dage efter operationen. Langs den rostrale-to-caudal akse tandede gyrus, sædvanligvis ca 10-30% af celler (svarende til i alt ca. 10,000-30,000 celler) udtrykker transgenet (erne) (figur 4A) 9. Andelen af mus, der dør på grund af operationen er ubetydelig (<5%). Tre uger overekspression af cdk4/cyclinD1 under disse betingelser udløser en stigning i NSC med over to-folder (fig. 4B), mens faldende neurogenese med 70% (figur 4C) 9.
Figur 4. Virkninger af virusinfektion. (A) 3D-rekonstruktion af 7 fluorescens billeder taget fra 40 um tykke serielle koronale sektioner (indsamle 1 hver 6) langs den rostrale-to-caudal akse hippocampus. GFP +-inficerede celler (grøn) og DAPI nuklear farvning (blå) i den tandede gyrus er vist (øverst). Lyse felt billeder af koronale sektioner svarende til dem vist i A (i midten) og 3D-repræsentation (nederst) af hele cerebrale hemisfære med hippocampus fremhævet med grønt pseudo (modificeret fra Allen Brain Atlas, www.brain-map.org ) . Hvide pile peger injektionsstedet. Lateral (L), rostral (R), og dorSAL (D) akser (x, y og z stereotaktisk koordinater) er vist (til højre). (B og C) Andel af nestin + NSC (B) og DCX + nyfødte neuroner (C) i befolkningen af GFP + inficerede celler 3 uger efter stereotaktisk injektion af GFP (hvid) eller cdk4/cyclinD1/GFP (sorte) virus. Bars = SD, p <0,005, n = 3. Grafer i B og C taget fra Artegiani et al. 2011.
Discussion
Et afgørende skridt for in utero elektroporation er kvalitet og renhed af DNA siden retningsbestemt vandring under afgivelse af de elektriske felter afhænger af dens ladning. Protokoller for DNA-oprensning, der ikke inkluderer fjernelse af yderligere ladede molekyler, såsom endotoksiner, kan føre til maskering af de naturlige DNA negative ladninger, der fører til dårlig levering. Det er klart, at røre de uterine vægge med elektroderne så tæt som muligt på det område, der rammes forbedre elektroporation effektivitet. Lige så vigtig er kvaliteten af de elektroder anvendt, da det er af afgørende betydning for opnåelsen af et optimalt elektriske felter. Micro-ridser ikke engang synlige med det blotte øje og / eller organiske rester, såsom spor af serum, lipider, og så videre, vil uundgåeligt akkumuleres over tid fører til elektroder mister deres egenskaber. Gamle og / eller snavset electropes er den mest sandsynlige årsag til et pludseligt fald i elektroporation effektivitet og dermed bør være replaced, så snart dette er bemærket. Mens relativt enkel, i livmoderen elektroporation typisk kræver et par ugers træning for at opnå tilfredsstillende og reproducerbare resultater. Denne teknik er meget alsidigt, da det kan anvendes, næsten på enhver organer og væv i det udviklende embryo. Bestemt, organer indeholdende et hulrum, såsom hjernen, er særligt lette at målrette og muliggøre en høj andel af transficerede celler på grund af den lette indsprøjtning af en relativt stor mængde DNA.
Et almindeligt problem i forbindelse med etablering stereotaksisk viral injektion er at have nogle inficerede celler og / eller til at målrette uønskede områder. Det første problem er hovedsageligt korreleret med injektion af lav titer virus. 293T celler med lavere antal passager i kultur vokse hurtigere og føre til højere virale titre. Anvendelse af celler ældre end ca. 20 passager anbefales ikke og midler til transfektion med mindre end 80% effektivitet vil ikke sikre en godvirusproduktion. Opblanding af det virale pellet er også kritisk, den virale suspension skal vises homogene og virale klumper, der kan tilstoppe kapillarrøret skal undgås. Vira er meget følsomme overfor temperaturen falder og langtidsopbevaring. Af disse grunde skal alikvoter til permanent lagret ved -80 ° C og kan ikke genfryses. Selv under disse betingelser, kan et fald i infektivitet observeres efter 6-12 måneders opbevaring. I de læring faser, foreslår vi at teste den virale titer af hver viral forberedelse og at gøre det igen efter lang tids opbevaring. Tilstedeværelsen af inficerede celler i uønskede områder af hjernen kan afhænge af en suboptimal positionering af muse hoved på stereotaktisk ramme, der kræver lidt øvelse. Desuden er det kritisk for ikke at beskadige overfladen af hjernen ved åbning af hullet på skallen, ellers vil det ikke være muligt at nulstille 0 korrekt på pial overflade, hvilket resulterer i unøjagtig injektion. Koordinaterneat vi i denne protokol henvises til C57/BL6 6-10 uger gamle hunner, og vi foreslår at optimere dem for anden stamme / alder / køn. Erhvervelse af denne teknik kan kræve mere tid end i utero elektroporation på grund af de længere faser, der er nødvendige for at forberede de vira og analysere prøverne. Vi anbefaler kraftigt, at virus kun anvendes efter mus kirurgi og stereotaktisk injektion er blevet pålidelig og reproducerbar. Det første trin til at opnå dette er at injicere celle-gennemtrængelige DNA-farvestoffer, såsom Hoechst 33342, i aflivet mus og analysere hjernerne straks.
I utero elektroporation og stereotaksisk viral injektion er to kraftfulde systemer til akut og væv-specifikt manipulere genekspression i CNS under pattedyr udvikling og voksenlivet. På trods af deres begrænsning i målretning kun en subpopulation af celler, giver disse systemer en hidtil uset hastighed og lethed i forhold til mere konventionelle metoder, jegn særlig arbejdskrævende og tidskrævende generering af transgene mus. Men på trods af denne lighed, eksisterer flere forskelle mellem de to teknikker, der er værd at nævne. Dels med hensyn til målretning af forskellige celletyper, in utero elektroporering oprindeligt fører til transfektion af stamceller egentlige (også kaldet radiale glialceller), fordi disse er de eneste celler, som afgrænser ventriklen hvor DNA'et injiceres. Som et resultat af celledelinger, vil plasmider efterfølgende arvet fra målrettede, mor stamceller til deres stamceller og / eller neuronale datterceller, der fører til en omfordeling af transficerede celler gennem hele cortex som funktion af tiden. I modsætning hertil fører anvendelsen af HIV lentivira i den voksne hjerne at samtidig infektion af hvilken som helst celletype, herunder stamceller, stamceller, neuroner og modne glialceller. Det skal bemærkes, er med hensyn til anvendelse af HIV lentivira i modsætning til mere almindeligt anvendte retrovirus det faktumat lentiviral integration vil forekomme uafhængigt af den mitotiske tilstand af celler, således at den målsøgende også for voksne, hvilende stamceller.
For det andet, en anden vigtig forskel mellem elektroporation og viral infektion er, at en forbigående, episomal ekspression opnås ved den tidligere i modsætning til den irreversible integration af DNA i genomet af inficerede celler opnået ved sidstnævnte. Som følge af på hinanden følgende celledelinger, fortynding af det elektroporerede plasmider, og nedbrydning af den ektopiske cyclinD1 proteinet, opstå ville i hver celle-cyklus. Således blev ekspansion af NSC under embryonisk udvikling vist at kun vare i omkring to dage 15, mens i den voksne hjerne denne effekt viste sig at varer i adskillige måneder (upublicerede resultater).
For det tredje, da i) cdk4/cyclinD1 har en stærkere virkning på celler med en længere G1 og ii) begået neurale stamceller under udvikling har en længere cellecyklusend stamceller, mens det modsatte gælder i voksenalderen, var vores to manipulationer fundet at udløse udvidelsen først og fremmest af neurale stamceller i løbet af udviklings-og stamceller i voksenalderen. I begge tilfælde en forøgelse af neuroner er blevet opnået med begge metoder.
Det fjerde, viral injektion kan let udføres, pålideligt og reproducerbart i mange forskellige regioner af den voksne hjerne ved blot at ændre stereotaxiske koordinater. I modsætning hertil kan præcis målretning af visse områder af centralnervesystemet, såsom hjernestammen, hippocampale dannelse, eller rygmarven, ved in utero elektroporering være vanskeligere at opnå reproducerbart. Selv stereotaktisk injektion kan udføres på mus i alle aldre, er optimal ydelse for in utero elektroporation begrænset fra ca E11 til E16. Trin før E11 ville kræve enten anvendelse af en ultralyd tilbagekastning mikroskop 18,19 eller et helt embryo kultUre-system 17,20.
For nylig er en stigende interesse for basal cellebiologi af somatiske stamceller blevet forfremmet, fordi deres undersøgelse og manipulation menes at være fundamental mod at udvikle nye cellebaserede regenerative behandlinger. Navnlig for overekspression af cdk4/cyclinD1 tilvejebringer vores protokol midlerne til forbigående forøger ekspansion af NSC in vivo (figur 3B og C og 4B og C) for at øge antallet af neuroner, der genereres i den voksne hjerne. Vi mener, at disse manipulation kan være vigtige i en række forskellige sammenhænge for bedre at forstå den rolle, som NSC i hjernens udvikling, evolution og homeostase samt deres bidrag til den kognitive funktion eller nyttiggørelse fra neural degeneration eller skade.
Disclosures
BA og FC har indsendt en patentansøgning beskriver betinget udvidelse af voksne somatiske stamceller ved cdk4/cyclinD1 vira (EP 10.160.288,6).
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Center for regenerative behandlinger, det medicinske fakultet af TU Dresden, og DFG Collaborative Research Center SFB655 (underprojekt A20). BA blev støttet af et fællesskab af udgravningerne-BB-program, Dresden. Vi takker Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, og Ravi Jagasia for værdifulde råd under etableringen af in utero elektroporation og stereotaktisk viral injektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
