Summary
Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.
Abstract
Somatik kök hücreler erişkin 1 sırasında embriyonik gelişim ve doku homeostazını sırasında doku oluşumu için esastır ek kök hücreler (genişletme) veya daha fazla farklılaşmış hücre tipleri (farklılaşma) oluşturmak için bölebilirsiniz. Şu anda, büyük çabalar bu rejeneratif tıp 1,2 için yeni stratejiler geliştirebilmek için oldukça önemli olduğuna inanılmaktadır çünkü farklılaşma genişleme somatik kök hücre anahtarını kontrol doğru yatırım vardır. Bununla birlikte, kök somatik hücre çalışma ve kullanımı önemli bir zorluk, genişleme kontrol etmek çok zor olduğu kanıtlanmıştır olmasıdır.
Burada cdk4/cyclinD1 kompleks ifadesi, G1 faz önemli bir düzenleyici işleyerek fare embriyonik korteks veya yetişkin hipokampus sinir kök / projenitör hücre kontrolü (tamamen NSC olarak anılacaktır) genişleme sağlayan bir sistem açıklanmaktadır hücre döngüsü ve somatik kök hücre differentiation 3,4. Özellikle, iki farklı yaklaşım cdk4/cyclinD1 kompleks in vivo olarak NSC aşırı eksprese edildiği de anlatılmıştır. Ilk yaklaşım olarak, hücre siklus düzenleyicileri ekspresyonu fare telencephalon lümeninde cdk4/cyclinD1 şifreleyen plazmit arasında episomal ifadesi tetikler, böylece lateral korteks MGK onları teslim utero elektroporasyon içinde izledi enjekte edilerek elde edilir transgenlerin 5-8. İkinci yaklaşım olarak, yüksek derecede konsantre HIV-türetilmiş virüs steriotaksik 9 enfekte hücrelerin genomuna entegre viral yapının sonra hücre döngüsü düzenleyicileri oluşumsal ekspresyonu tetikleme, böylece, erişkin fare hipokampusun dentat girus enjekte edilir. Olan temel ilkeleri zaten diğer video protokolleri 10-14 tarafından tarif edilmiştir Her iki yaklaşım da, burada i optimize edildi), ii doku hasarını azaltmak) çok özel bir beyin regio hedefi geniş bölümlerins, iii) her bir bölge dahilinde işletilen hücrelerin yüksek sayıda elde etmek, ve iv) her bir hücre içinde transgenlerin yüksek ifade seviyeleri tetikler. Iki yaklaşım kullanılarak transgenlerin geçici aşırı nedeniyle Cre-ifade sırasıyla, MGK loxP siteleri tarafından çevrili cdk4/cyclinD1 taşıyan virüsleri ile enfekte 9,15 hücre bölünmesi veya tamoksifen kullanımı için electroporated plazmidler doğal seyreltme ile yani farklı yollarla elde edilir .
Bu yöntemler akut ve doku-özellikle fare beyin herhangi bir gen ekspresyonu işlemek için çok güçlü bir platform sağlar. Özellikle, cdk4/cyclinD1 kompleksi ifade işleyerek, bizim sistem sonuçta memeli beynindeki nöronlar üretilen sayısının arttırılması, böylece, temporal NSC genleşme kontrolü ve farklılaşması için kendi geçiş sağlar. Bizim yaklaşımımız temel araştırmalar için çok önemli olduğu ve tedavi için somatik kök hücreleri kullanarak olabilirMemeli merkezi sinir sisteminin i daha iyi bir anlayış) sunarken somatik kök kullanarak) yetişkinlik, iii sırasında) gelişimi, ii sırasında daha bilişsel işlevlerde yetişkin nöron rolü, ve belki, iv) doku homeostazında doku oluşumu için hücre katkısı kök nörodejeneratif hastalıkların modellerinde hücreler.
Protocol
Hazırlık notu
Cerrahi hayvan refahı için yerel makamların onayı ile tam eğitimli müfettişler tarafından yapılmalıdır. Tüm önlemler derin anestezi, postoperatif analjezi yönetimi ve fazla 10 dk, kornea dehidratasyon ve körlüğü önlemek için göz yağ uygulaması süren operasyonları için dahil hayvana verdirdiler ağrı ve stres en aza indirmek için alınması gerekir. Anestezi fareler 37 sürekli sıcak tutulmalıdır ° C tam kurtarma ve her cerrahi alet ve çözüm steril olmalıdır kadar. Biyolojik bir kaput kullanımı kesinlikle gerekli olmamasına rağmen, operatör bir laboratuvar önlüğü, maske ve eldiven giyerek operasyon sırasında hayvanın enfekte olasılığını en aza indirmek için tüm makul önlemleri almalıdır. Benzer şekilde, virüs üretimi ve kullanımı ile ilgili her adımda izin verilmesi gerekir ve yerel makamların yönetmeliklerine göre S2 alanlarda yapılmalıdır.Son olarak, virüs ile temas olabilirdi tüm alet ve yüzeylerin tam bir dekontaminasyon tesis onaylanmış dezenfeksiyon uygulamaları (HIV için% 70 Et-OH ve / veya otoklav ile silerek) göre yapılmalıdır.
Bölüm 1: Embriyonik MGK Genişletme
1. Utero elektroporasyon yılında
- Klonlamadan sonra PCM'ler-EGFP (Clontech) ya da pDSV-mRFPnls vektörler 16 içinde transgenlerin (yani cdk4/cyclinD1), 3-5 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile steril PBS içinde tekrar süspansiyon ve EndoFree kit kullanılarak plazmid arındırmak. Yakında ameliyat öncesi, ca son oranında PBS içinde% 0.05 FastGreen ile plazmid karıştırın. 4:04:01 ve tüm çökelti kaldırmak için 16,000 x g'de 2 dakika süre ile karışım santrifüjlenir.
- Önceden çekilmiş borosilikat cam kapiller içine DNA karışımı yerleştirin. P-97 pipet çektirmesi kullanarak Çekme parametreler şunlardır: pull: 200; vel: 140; süresi: 140. Isı bir rampa testi tarafından verilen ve spec bağlıdırkılcal IFIC çok kullanılmaktadır. Utero elektroporasyon platformu (Şekil 1A) yakın olduğu PicoPump memesi üzerinde kılcal takın ve bir stereomikroskop altında, ucu ve dönüm noktasında nick kıvırın.
- Bir kuru cam boncuk sterilizatör tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve derin bir izofluran buharlaştırıcı kullanılarak gebelik gün 12-15 hamile bir fare uyutmak. 37 ° C'de ayarlanmış bir ısıtma platform üzerinde sırtüstü pozisyonda hayvan koyun ve bir burun konisi içinde sabit izofluran idaresi altında tutmak.
- Karın cilt Tıraş, sonunda% 70 etanol ile arasındaki silerek Betaisodona birden çok kez dezenfekte ve 0.1 mg / rüçhan analjezik olarak kg konsantrasyonda subkutan buprenorfin (PBS içinde seyreltilmesi) enjekte. Ince makas kullanılarak, periton boşluğuna ulaşmak için temel kas duvarın daha sonra 2 cm'lik bir uzunlamasına kesim ve deri, yapmak. Periton ca dağıtın. 2IUE çözeltisi (D-PBS pen / strep 100 U / ml içeren), bir ml önceden ısıtılmış 37 ° C ve bir ısıtma bloğu üzerinde çözelti tutmak.
- Uteruslar çıkarılır hangi bir yarık içeren steril drap ile fare kaplayın. Bir tungsten retraktör kullanarak kesi çekin, rahim belirlemek ve bitişik embriyoları arasında forseps (Şekil 1B; solda) ile tutarak çekin ve nihayet steril drap üzerine uzandı. Bütün operasyon sırasında, organ ve vücut boşluğuna nemlendirmek ve hayvan dehidratasyonu önlemek için İEÜ çözümü ile rahim durulayın.
- Dikkatli başparmak ve işaret arasındaki tutarak rahim tutun ve başını operatöre doğru görünür ve odaklı kadar tek embriyo çevirin. Telencephalic hemisfer belirleyin ve dorsolateral taraftan biri enjekte. Ventrikül FastGreen (; sağ Şekil 1B) tarafından özetlenen kadar PicoPump bir ayak pedalı kullanarak DNA çözeltisi 1-2 ul bırakın.
- Tüm embriyolar enjekte ve electroporated zaman, karın boşluğuna geri rahim yerleştirin ve her 3-4 mm dikilmesi dikiş dizeyle kas duvarları kapatın. Knot kas rahat ancak doku küçük bir şişlik izin vermeyecek kadar sıkı olmadığını edilmelidir. Son olarak, metal klipler kullanarak örten cilt kapatın. Betaisodona ile cildi dezenfekte, izofluran maskeden fareyi çıkarın ve tamamen uyanık bir konut kafes içinde aktarın. Lokomotor davranışlar normaldir kadar fare kurtarma izleyin.
2. Sam İşlemeple
- Bir veya daha fazla gün elektroporasyon sonra, fare feda embriyolar toplamak ve doğru bir floresan stereomikroskopta (Şekil 1D) kullanarak electroporated olanlar tespit. Buz gibi soğuk PBS beyinleri teşrih ve% 4 PFA (fosfat tamponu, pH 7.4 'te paraformaldehit) gecede onları düzeltmek. Sonunda, BrdU hücre döngüsü kinetiği ve hücre çoğalması 3 araştırmak için farklı paradigmalara göre kurban öncesi uygulanabilir.
- Beyinleri sonra kesit ve vardır hedefli MGK ve yavrularının üzerine fonksiyonel transgenlerin etkisini değerlendirmek için radyal glia ve çeşitli belirteçler, bazal ataları ve nöronlar (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 vb) için immün işlenir co-electroporated raportör geninin ifadesi ile tanımlanır.
Şekil 1.Utero elektroporasyon yılında. Utero elektroporasyon platformu bir (A) şematik gösterimi. (B) ameliyat sırasında hamile farenin konumlandırma (sağda) ve bir fare embriyo (solda) telencephalic yarımkürede DNA / FastGreen karışımı (mavi) enjeksiyonu gösteren resimler. (C) Şema enjeksiyon bölgesinde (mavi) bitişik anot (+) ile rahim duvarları ile temas halinde elektrot yerleştirme göstermektedir. Oklar anoda doğru DNA göçü göstermektedir. Embriyonik gün 13 yaşında GFP plazmid ile elektroporasyon sonra fare embryo 24 saat (D) resmi. Kesikli çizgi telencephalic yarımkürede demarcates. Bir Calegari ark güncellenmiştir., 2004 17 Programı.
Bölüm 2: Yetişkin MGK Genişletme
1. HIV-kaynaklı viral parçacıkların Üretimi
- 1. Gün: levha 5 x 10 10 cm 6 293T hücreleriD-MEM ısı inaktive fetal sığır serumu% 10 ve pen / strep (kültür ortamı) 100 U / ml içeren 8 ml çanak. 37. az bir viral hazırlama ve bir gece boyunca kültür için 15 bulaşık kullanımı ° C,% 5 CO2.
- 2. Gün: her bir tabak için, i) şifreleyen 3 plasmidlerin her biri düz D-MEM 5, ug, 1 ml VSVG (veziküler stomatit virüsü tip G) zarf proteini, ii) Gag / pol (grup spesifik antijen / polimeraz) seyreltik ve iii) polisistronik önce 9 HIV tabanlı aktarım vektörü (p6NST90) klonlanmış fonksiyonel ve muhabiri transgenlerin (yani cdk4/cyclinD1/GFP) ifade oluşturmak. D-MEM, oda sıcaklığında 15-30 dakika için 1 mg / ml stok çözeltisi ile inkübe de PBS içinde önceden çözülmüş edilmiş polietilenimin 45 ul ihtiva eden 1 ml bu çözelti karıştırılır. Bu arada, hücreleri bulunan ortamı çıkarın ve ısı inaktive fetal sığır serumu% 15 ve 100 U / pen / strep ml içeren taze D-MEM tabak başına 4 ml ekleyin. 2 m ekletransfeksiyon karışımı ve kültür gecede l.
- 3. Gün: 500 mM 120 ul transgenlerin ekspresyonu artırmak için çanak başına Na-bütirat eklemek, kültür ortamı 5 ml transfeksiyon ortamı yerine sonra 6-8 saat boyunca nazikçe ve kültür karıştırın.
- 4. Gün: süpernatan (yaklaşık 70 ml toplam) toplamak, 2 polyallomer santrifüj tüpleri (35 x 89 mm) bir 0.22 mikron filtre ve transfer geçecek. 4. 90 dakika boyunca 110,000 xg'de Ultrasantrifüj ° C bir salıncak rotor kullanarak. Süpernatant atın her bir tüpe PBS 6 ml eklenir ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Pelletini tekrar ve bir polyallomer santrifüj tüpüne (14 x 95 mm) olarak aktarabilirsiniz. 4. 90 dakika boyunca 110,000 xg'de Ultrasantrifüj ° C bir salıncak rotor kullanarak. Süpernatant sil, 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon pelet, -80 5 ul alikot ve depo etmek ° C. Viral titresi 10 8 -10 9 cfu / ml aralığında olacaktır. (Not: virüs sıcaklık ve depolama, avo çok duyarlıdırid yeniden dondurma, nakliye sırasında kuru buz üzerinde tutmak ve kullanımdan önce yakında eritin.)
2. Stereotaksik enjeksiyonu
- Izofluran ile 6-10 hafta eski fare anestezisi ve düzgün kafa düzeltmek için kulak çubukları ve damak desteği kullanarak bir stereotaksik frame (Şekil 2A) yüzüstü pozisyonda hayvan koyun. Hayvan 37 ° C'de ve sürekli izofluran idaresi altında ayarlanmış bir ısıtma yastığı sıcak tutulur.
- Subkutan rüçhan analjezik olarak buprenorfin çalışma solüsyonu 100 ul enjekte, fare kafasına deri bir şerit tıraş, ve 1.4 'te açıklandığı desinfect. Bir neşter kullanılarak, ca yapmak. Sutur düzeyinde kafatası ortaya kafa derisi üzerinde 1,5 cm uzunluğunda longitudinal kesi. Deri çekin ve yavaşça steril bir pamuk ile kemik yüzeyi temizleyin.
- Parafin yağı ile kılcal cam (1.2 spesifikasyonları) Yarım doldurup taktıktan enjektör pompası üzerine monteikinci halka (Şekil 2B) kadar kapiler. Kılcal uç bregma, sagital ve yan dikişler (Şekil 2C) (stereomikroskop yardımı ile tespit edilir) arasında kesişme noktasıdır, üzerinde konumlandırılmış kadar, x, y ve z ekseninde kılcal tutucu taşı, ve re-set x, y ve z değerlerini 0.
- Ön-arka eksen (y) olarak ± medio-lateral ekseninde 1.6 mm (x) ve -1.9 mm kapiler hareket ettirin ve bir cerrahi işaretleyici kalem kullanarak kemik işaretleyebilirsiniz. Ca bir delik açın. Beynin zarar vermemeye dikkat elektrikli delici kullanarak kafatası üzerinde 0,5 mm çap.
- Kulak çubukları yerleştirilir parafilm bir parça viral süspansiyonu 5 ul damla (1 tablet) koyun ve damlacık içinde kılcal ucu immerge. Ca Suck. Bir nanolitre enjektör kullanarak viral süspansiyonunun 3.5 ul 55 nl / sn olarak belirlenmiştir. Damlacık buharlaşması gibi hızla bu adımı uygulayın.
- Site o kadar kılcal taşıyınf enjeksiyon ve ucu pial yüzeyine temas edene kadar aşağı hareket ettirin. 0 dorso-ventral eksen değeri (z) sıfırlayın. Bu noktada, -1.9 mm kılcal ile dokuya nüfuz eden ve 4 nl / sn bir hızda viral süspansiyon 1.5 ul bırakın. Viral süspansiyon yalak kılcal parça geri akışının en aza indirmek ve daha sonra kılcal geri çekilmesi için 2-3 dakika bekleyin. Ikinci bir enjeksiyon controlateral hemisferde gerçekleştirilebilir.
- , Cilt dikişleri dezenfekte etmek ve rahim elektroporasyon (1,8) 'de daha önce tarif edildiği gibi hayvan anestezi kurtarmak için izin verir.
Şekil 2. Stereotaksik Viral enjeksiyondan. Stereotaksik enjeksiyon (A) ve ca ekleme gösteren bir sökülüp kılcal tutucu gerçekleştirmek için gerekli bileşenler (A ve B) şematik gösterimiİkinci halkayı (B) kadar pillary. (C) cilt ile kulak çubukları ve damak desteği ile immobilize fare kafası resmi kafatası (solda) maruz kesti. Noktalı kutu büyütme (sağda), lateral ve sagittal sütür, bregma ve enjeksiyon (daire) site gösterir.
3. Örnek İşleme
- Bir-üç hafta sonrası enfeksiyon, ca fare serpmek. % 4 PFA 100 ml, beyin teşrih ve% 4 PFA gecede sonradan düzeltmek. Sonunda, BrdU ve / veya tamoksifen, sırasıyla 9, hücre döngüsü kinetiği araştırmak için ve loxP siteleri ile çevrili viral transgenlerin ifade durdurmak için farklı paradigmalar göre fedakarlık etmeden önce tatbik edilebilir.
- Beyin sapı ve ataları hücreleri ve nöronlar (örneğin Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublekortin, vb) birkaç işaretleyiciler kullanılarak immünboyama için işlenebilir.
Representative Results
- Genel olarak, rahim içinde elektroporasyon yanal korteks (Şekil 3A), geniş bir alan içinde raportör gen ekspresyonu görüntüleme, güçlü electroporated embriyoların yaklaşık% 60-80 kadarı elde edilir. Floresan proteinler kolayca bir haftadan daha uzun süren sinyal ile ameliyattan sonra en kısa sürede 3-6 saat gibi tüm montaj embriyolar tespit edilebilir. Hedeflenen bölgede, hücreler yaklaşık% 30-50, genellikle hücre oranları genelde% 90'ın üzerinde olmak üzere iki (veya daha fazla) co-electroporated transgenlerin (Şekil 3B, sol) 6,8 birlikte ifade ile transgen (ler) i ifade , 15. Apoptoz (yaklaşık% 2.0-2.5), minimal bir düzeyde elektroporasyon yaklaşık 2 saat sonra gözlenebilir iken, bu değer yaklaşık 6 saat sonra fizyolojik düzeyde (yaklaşık% 0.5-1.0) (FC, yayınlanmamış veri) dönecektir. Ameliyat nedeniyle ölmekte olan embriyoları veya gebe farelerin oranı (<% 5) genellikle ihmal edilebilir düzeydedir. Bu koşullar altında cdk4/cyclinD1 Co-elektroporasyon 4 takibenGelişme 8 saat% 30 sinir progenitör genişleme (sağ Şekil 3B, ve C) 15 bir artış tetikler.
Şekil 3,. Cdk4/cyclinD1 fazla ifadesi tarafından sinir progenitor hücrelerin büyütülmesi. 24 saat embriyonik gün 13'te, GFP ve TTT plazmidler ile elektroporasyon sonra bir fare embriyo korteks aracılığıyla bir yanal kesit bölgesinin (A), floresans resim. (B) temel projenitör işaretleyici Tbr2 için cdk4/GFP ve cyclinD1/RFP plasmidler ve immün ile birlikte elektroporasyon sonra bir 48 saat içinde olduğu gibi floresan resimler. DAPI counterstainig (solda) ve Tbr2 ile Floresan gazetecilere (sağ) gösterilir. Ve subventricular bölge sınırları (SVZ; sarı kesikli çizgiler); Hatları ventriküler zonun apikal yüzeyi (beyaz çizgi VZ) gösterir. Artan thi notartan üretim ve cdk4/cyclinD1 ekspresyonu sonra bazal progenitor hücrelerin genişlemesi nedeniyle korteks electroporated kısım (beyaz ok başları) içinde SVZ arasında ckness. P <0.05, n = 3 (C) etki miktarının B. Çubuklar = SD de gösterilmiştir. C çubuk grafik Lange, et al., 15, 2009 alınır.
- Sonra viral stereotaksik enjeksiyon, ca. Çalışan farelerin% 80'i bütün dentat girus boyunca transgenlerin güçlü ifadesini görüntüler. GFP oluşumsal ekspresyonu kolayca ameliyat sonrası hemen 4 gün olarak 40 um kesitler üzerinde tespit edilebilir. Dentat girus rostral-to-kuyruk eksen boyunca, hücrelerin yaklaşık% 10-30 (ca toplam. 10,000-30,000 hücreler denk) genellikle transgen (lar) (Şekil 4A) 9 ifade eder. Nedeniyle cerrahi için ölüyor farelerin oranı (<% 5) ihmal edilebilir düzeydedir. Bu koşullar altında cdk4/cyclinD1 üç hafta boyunca aşırı ekspresyonu ile NSC bir artış tetikler ikikıvrımlar (Şekil 4B) 9% 70 (Şekil 4C) tarafından nöron azaltırken.
Şekil 4. Viral enfeksiyon Etkileri. Hipokampüsün rostral-to-kaudal ekseni boyunca 40 mikron kalınlığında seri koronal kesitler (1 her 6 toplanması) alınan 7 floresans resimleri (A) 3D rekonstrüksiyon. GFP + enfekte hücreleri (yeşil) ve dentat girus DAPI nükleer boyanma (mavi) (üst) gösterilir. A (orta) ve (; Allen Brain Atlas modifiye yeşil yalancı vurgulanan hipokampus ile tüm serebral hemisferin 3D gösterimi (alt) gösterilenlere karşılık koronal kesitlerin Aydınlık alan resimlerin www.brain-map.org ) . Beyaz oklar enjeksiyon yerinde işaret. Yanal (L), rostral (R) ve dorsal (D) ekseni (x, y ve z, stereotaksik koordinatlar) (sağ) gösterilmiştir. Nestin NSC + (B) ve DCX + GFP nüfus içinde yeni doğmuş nöron (C) + 3 hafta stereotaksik GFP (beyaz) ya da cdk4/cyclinD1/GFP enjeksiyonu (siyah) virüs sonra enfekte olmuş hücreleri (B ve C) oranı. Barlar = SD, p <0.005, n = 3. B ve C olarak grafikler Artegiani ve ark., 2011 alınmıştır.
Discussion
Utero elektroporasyon in için hayati bir adım elektrik alanların teslimi sırasında yönlü göç şarjı bağlıdır yana DNA kalite ve saflık olduğunu. Gibi endotoksinler gibi ek yüklü moleküllerin çıkarılması dahil değildir DNA arıtma için Protocols Düşük uygulama giden doğal DNA negatif yük maskeleme yol açabilir. Açıktır ki, mümkün olduğunca yakın hedef alınacak bölgeye elektrotlar ile uterin duvarlara dokunmadan elektroporasyon verimliliğini artıracaktır. Aynı derecede önemli olan bu optimum elektrik alanların teslimat için esastır beri kullanılan elektrotlar kalitesidir. Göz ve / veya benzeri serum izleri, lipidler, ve benzeri gibi organik artıklar, tarafından bile görünmez mikro-çizikleri, kaçınılmaz olarak kendi özelliklerini kaybetmeden elektrotlar giden zaman içinde birikir. Eski ve / veya kirli electropes elektroporasyon verimlilik ani bir düşüş en olası nedeni vardır ve böylece r olmalıdıren kısa sürede bu fark olarak eplaced. Nispeten daha basit olmakla birlikte, uterus elektroporasyon tipik olarak tatmin edici bir şekilde ve yeniden üretilebilir sonuçların elde edilmesi için çalışma içinde bir kaç hafta gerekmektedir. Bu gelişen embriyonun her organ ve doku için, hemen uygulanabilir, çünkü bu tekniği çok yönlüdür. Kuşkusuz, beyin gibi bir kaviteye içeren organlar ve hedef DNA, görece geniş bir hacim enjekte etme kolaylığı nedeniyle, transfekte edilmiş hücreleri bir oranını sağlamak için özellikle kolaydır.
Stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasında karşılaşılan yaygın bir sorun kaç enfekte hücreleri ve / veya istenmeyen alanlarda hedeflemektir. İlk sorun çoğunlukla düşük titrede virüs enjeksiyonu ile ilişkilidir. Kültür pasajların düşük sayı ile 293T hücreleri daha hızlı büyür ve daha yüksek viral titreleri yol. Ca daha eski hücreleri kullanarak. 20 pasajlar önerilen ve en az% 80 verimlilik ile aktarılmasının anlamına değil iyi bir garanti vermezviral üretimi. Viral pelet yeniden süspanse edilmesi de önemlidir, viral süspansiyon kılcal kaçınılması gerekir tıkamak homojen olabilir ve viral kümeleri görünmesini sahiptir. Virüsler sıcaklığı düşer ve uzun süreli depolama için çok duyarlıdır. Bu nedenlerden ötürü, aynı hacimde kalıcı olarak -80 ° C'de saklanabilir ve refrozen olamaz gerekir. Hatta bu koşullar altında, enfektivite bir azalma depolama 6-12 ay sonra tespit edilebilir. Öğrenme aşamaları, her bir viral hazırlama viral titresi test etmek ve uzun süreli depolamadan sonra tekrar yapmak öneririz. Beynin istenmeyen bölgelerde enfekte hücrelerin varlığı biraz pratik gerektirir stereotaksik çerçeve üzerinde fare kafası suboptimal konumlandırma bağlı olabilir. Buna ek olarak, aksi takdirde kesin olmayan enjeksiyon ile sonuçlanan, pial yüzey üzerinde doğru bir şekilde 0 sıfırlamak için mümkün olmayacaktır çünkü kafatası üzerinde delik açma sırasında beyin yüzeyine zarar vermemek için kritik önem taşır. KoordinatlarıBu protokolde sağladığı C57/BL6 6-10 hafta eski kadın adlandırılır ve biz farklı suşu / yaş / cinsiyet için onları optimize etmenizi öneririz. Bu tekniğin kazanılması virüsler hazırlamak ve örnekleri analiz etmek için gerekli uzun evreleri nedeniyle utero elektroporasyon daha fazla zaman gerektirebilir. Önemle fare cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon güvenilir ve tekrarlanabilir hale geldikten sonra virüs sadece kullanılır öneririz. Bunu başarmak için ilk adım ötenazi fareler gibi Hoechst 33342 gibi hücre geçirgenler DNA'nın boyalar, enjekte ve hemen beyinleri analiz etmektir.
Utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon olarak iki güçlü akut sistemleri ve doku-spesifik memeli gelişimi ve yetişkinlik döneminde sinir sistemindeki gen ekspresyonu işlemek vardır. Hücrelerin sadece bir alt hedefleme kendi sınırlamaya rağmen bu sistemler, benzeri görülmemiş bir hız sağlamak ve daha geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında kolaylığı, itransgenik farelerin n özellikle zahmetli ve zaman alıcı nesil. Ancak bu benzerliklere rağmen, çeşitli farklılıklar bahsedilmeye değer iki teknik arasında var. Bu DNA enjekte edilir karıncık sınırlayan tek hücreler, çünkü İlk olarak, rahim elektroporasyon, farklı hücre tiplerinin hedefleme ile ilgili olarak başlangıçta uygun kök hücreler (glia hücreleri aynı zamanda radyal olarak da adlandırılır) ve transfeksiyon yol açar. Hücre bölünmesinin bir sonucu olarak, plazmid daha sonra bunların öncül ve / ya da zamanın bir fonksiyonu olarak korteks boyunca, transfekte edilmiş hücreleri dağıtılması yol açan sinirsel yavru hücrelere hedeflenen, ana kök hücreleri, miras edilecektir. Buna karşılık, yetişkin beyin HIV lentiviruses kullanımı kök hücreleri, öncü hücrelerden, nöronlar gibi olgun glial hücreler de dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipi eşzamanlı enfeksiyona yol açar. Not, daha yaygın olarak kullanılan retrovirüsler karşıt olarak, HIV lentiviruses kullanılarak ilgili olmasıdırO lentiviral entegrasyonu dolayısıyla yetişkin, sessiz kök hücrelerinin de hedefleme sağlayan bağımsız hücrelerin mitotik devletten oluşacak.
İkincisi, elektroporasyon ve viral enfeksiyonu arasındaki bir başka önemli fark, ikinci elde enfekte hücrelerin genomundaki DNA geri dönülmez bütünleşme aksine bir geçiş, episomal ifadesi eski elde olmasıdır. Birbirini takip eden hücre bölünmesi, electroporated plazmid seyreltme, ve ektopik SiklinD1 protein yıkımı bir sonucu olarak, her bir hücre döngüsünde izleyecek. Bu etki birkaç ay (yayınlanmamış sonuçlar) sürer bulunmuştur yetişkin beyin içinde iken Böylece, embriyonik gelişimi sırasında MGK genişleme sadece son yaklaşık iki gün için 15 ile gösterilmiştir.
I) cdk4/cyclinD1 gelişimi sırasında) işlenen nöral öncüllerinden daha uzun G1 ve ii olan hücreleri üzerinde güçlü bir etkisi vardır beri Üçüncüsü, uzun bir hücre döngüsü vardırtersi yetişkinlik döneminde de geçerlidir ederken dışındakilerden kök hücre, bizim iki manipülasyonlar yetişkinlik döneminde kalkınma ve kök hücre sırasında nöral progenitörlerinin genişlemesi, öncelikle, tetiklemek için bulunmuştur. Her iki durumda da nöronlar bir artış her iki yöntem ile elde edilmiştir.
Dördüncü olarak, viral enjeksiyon kolayca sadece stereotaksik koordinatlar değiştirerek, yetişkin beyin pek çok farklı bölgeler içinde, güvenilir ve tekrarlanabilir, gerçekleştirilebilir. Buna karşılık, uterus içinde elektroporasyon yoluyla bu gibi beyin sapı, hipokampal oluşumunun ya da spinal kord gibi merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde, kesin hedefleme çoğaltılabilir şekilde elde etmek için daha fazla zor olabilir. Stereotaksik enjeksiyon herhangi bir yaştaki fareler üzerinde yapılabilir iken Ayrıca, uterus içinde elektroporasyon optimum performans için E16 E11 yaklaşık sınırlıdır. Öncesinde E11 Adımlarını bir ultrason backscatter mikroskop 18,19 kullanımı ya da bir bütün embriyo kült ya gerektirecektirure sistemi 17,20.
Kendi çalışma ve manipülasyon yeni hücre tabanlı rejeneratif tedaviler geliştirmeye yönelik temel olduğu düşünülmektedir, çünkü son, somatik kök hücrelerin temel hücre biyolojisi artan bir ilgi teşvik edilmiştir. Cdk4/cyclinD1 ekspresyonu için, özellikle bizim protokol transitorily erişkin beyninde üretilen nöron sayısını artırmak amacıyla in vivo MGK genişleme (Şekil 3B ve C ve 4B ve C) artırmak için bir araç sağlar. Biz bu manipülasyon iyi beyin gelişimi, evrim ve homeostasis yanı sıra bilişsel işlev veya sinir dejenerasyonu ya da yaralanma kurtarma katkıları içinde MGK'nın rolünü anlamak için farklı bağlamlarda bir dizi önemli olabilir inanıyoruz.
Disclosures
BA ve FC cdk4/cyclinD1 virüsler (EP 10.160.288,6) tarafından erişkin somatik kök hücrelerin koşullu genişleme açıklayan bir patent başvurusu gönderdiniz.
Acknowledgments
Bu çalışma Rejeneratif Terapiler, TU Dresden Tıp Fakültesi ve DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezi SFB655 (alt proje A20) Merkezi tarafından desteklenmiştir. BA kazılar-BB programı, Dresden bir burs ile desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie ve utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasını sırasında değerli tavsiye Ravi Jagasia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
