Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.
L'interrogazione di espressione genica delle cellule beta e funzione in vitro è spostato esattamente negli anni dallo studio di linee cellulari tumorali roditore allo studio di isole isolate roditori. Isole principali offrono il vantaggio che più rispecchiano fedelmente la biologia di vie di segnalazione intracellulare e risposte secretorie. Considerando che il metodo di isolamento delle isole utilizzando tessuti dissociando enzimatici (TDE) preparativi è stato ben definito in molti laboratori di 1-4, le variazioni nella consistenza della resa delle isole e di qualità da qualsiasi ceppo roditore dato limitare la portata e la fattibilità di studi delle isole principali. Queste variazioni si verificano spesso come risultato delle TDES grezzi parzialmente purificati utilizzati nella procedura di isolamento isolotto; TDES spesso presentano lotto a lotto variazioni nell'attività e spesso richiedono adattamenti della dose di enzima impiegato. Un piccolo numero di report hanno utilizzato purificato TDES per isolamenti cellulari roditore 5, 6 </sup>, ma la pratica non è diffusa, nonostante l'uso di routine ed i vantaggi di purificato TDES per isolamenti delle isole umane. In collaborazione con VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), abbiamo sviluppato un protocollo modificato isolotto topo isolamento basato su quello descritto da Gotoh 7, 8, in cui vengono perfuse le TDES direttamente nel dotto pancreatico di topi, seguito da frazionamento tessuto greggio attraverso un gradiente Histopaque 9, e l'isolamento di isolotti purificato. Una differenza significativa nel nostro protocollo è l'uso di collagenasi purificata (CI zyme MA) e neutro proteasi (CI zyme BP) combinazione. La collagenasi è caratterizzato dall'uso di un collagene 6 degradante attività di fluorescenza (CDA) saggio che utilizzato contrassegnati in modo fluorescente solubili fibrille vitello come substrato 6. Questo substrato è più predittiva della cinetica di degradazione del collagene nella matrice del tessuto perché si basa su collagene nativo come substrato. La proteasi è characterized con un sensibile test di fluorescenza cinetica 10. Utilizzando questi saggi migliori insieme con la più tradizionale analisi biochimiche consentire la TDE da produrre in modo più coerente, con conseguente miglioramento delle prestazioni la coerenza tra i lotti. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per la massima resa isolotto e morfologia isolotto ottimale utilizzando topi C57BL / 6. Durante lo sviluppo di questo protocollo, diverse combinazioni di collagenasi e proteasi neutre stati valutati a diverse concentrazioni, e il rapporto finale di collagenasi: proteasi neutra di 35:10 rappresenta enzima prestazioni paragonabili a Sigma tipo XI. Poiché significativa variabilità delle rese insule media da diversi ceppi di topi e ratti sono stati riportati, ulteriori modifiche della composizione TDE dovrebbe essere fatto per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da diverse specie e ceppi.
In questo protocollo, abbiamo descritto la nostra procedura per l'incannulazione, perfusione con collagenasi, e la dissociazione del pancreas murino, con lo scopo di isolare le isole di Langerhans. Tecnicamente, il nostro metodo, una volta appreso, dovrebbe consentire l'isolamento del pancreas entro 4 min eutanasia degli animali, e per 1 ora dovrebbe comportare l'isolamento di isole da un singolo animale. La rapidità della tecnica ci permette di isolare isolotti da fino a 12 topi a un tratto tipico, ottenendo in tal modo l'isolamento di fino a 3.000 isolotti.
A differenza di altri protocolli che utilizzano preparazioni grezze di collagenasi, il nostro protocollo è caratterizzata dall'uso di proteasi purificata, CI zyme Collagenasi MA CI enzima proteasi e BP. Variazioni nella consistenza dei preparati TDE che sono commercialmente disponibili richiede che ciascun lotto singolarmente testato e ottimizzato prima uso generale. Questo lotto a lotto variabilità ci ha portato a prendere in considerazione l'uso di PuriTDES cati da VitaCyte. Questi TDES altamente purificate sono caratterizzati da più metodi tra cui l'uso di sensibili saggi fluorescenza substrato marcato. Il saggio di fluorescenza CDA è più sensibile alle diverse forme molecolari di collagenasi che hanno differenti cinetiche in degradante collagene nativo. Saggi storici substrato peptidico fornire una valutazione incompleta di collagenasi. Caratterizzare collagenasi con metodi diversi assicura una maggiore attività enzimatica tra i lotti.
Sulla base della nostra in-house test utilizzando una varietà di preparazioni collagenasi disponibili in commercio, abbiamo trovato che le combinazioni di enzimi purificati prodotto riproducibili da lotto a lotto risultati. I vantaggi principali di usando TDES altamente purificata e rigorosamente caratterizzato in questa applicazione sono una composizione enzimatica ottimale è definito, il lotto a lotto costanza delle prestazioni è assicurato. Tale coerenza elimina il laborioso processo di qualificazione partita normalmente richiestocollagenasi per prodotti grezzi o arricchito. TDES purificati anche consentire ulteriori modifiche della composizione per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da differenti ceppi di topi. Notifica composizioni enzimatiche ottimali per l'isolamento di isolotti da diversi ceppi di topi possono essere più efficacemente comunicata. Questo, a sua volta, porta ad un uso più produttivo delle risorse e maggiore flessibilità nel disegno sperimentale.
Ci sono molti passaggi critici che possono influenzare il risultato di isolamenti delle isole con il nostro protocollo. La prima è la necessità di ottenere un gonfiaggio efficace del pancreas durante la perfusione del preparato enzimatico. È importante iniziare il gonfiaggio con forza dolce sulla siringa, e aumentare la forza come si gonfia pancreas. E 'utile per spostare l'intestino e sollevare il pancreas durante il gonfiaggio in modo che la collagenasi perfusione l'intero organo. Un altro passo importante è la forza con cui si scuote il afte tubir incubazione a 37 ° C (fase 2.2). Abbiamo trovato che scuotendo il pancreas duro contro il tappo della provetta provoca frammentazione di isolotti, ma senza alcuna forma di dissociazione meccanica in questa fase, i rendimenti insule può cadere drammaticamente. È inoltre indispensabile che durante la fase di dissociazione con la siringa (passo 2.5), un livello medio forza viene applicata durante il movimento su e giù con lo stantuffo, questo assicura un'adeguata dissociazione tessuto prima della fase di filtrazione (2,6), dove poco il tessuto deve essere trattenuta dal filtro colino da tè. Infine, l'ultimo passo da seguire con attenzione è l'aspirazione di tutta la 20 ml delle isole HISTOPAQUE frazionati. Anche se isole sono in genere a livello di interfaccia del HISTOPAQUE e HBSS, abbiamo scoperto che si perde isole quando cerchiamo di rimuovere solo l'interfaccia, invece, ora rimuovere l'intero 20 ml con un ampio passaggio pipetta 25 ml. Abbiamo aggiunto la filtrazione attraverso il filtro inverso 70 micron (passo 2.11) per eliminare la necessità di centrifuge le isolette più volte per lavare via il HISTOPAQUE.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (sia per RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |