Подробное описание изоляции мыши островка описывается с помощью техники на месте панкреатического протоков катетеризации и перфузии сочетание очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы.
The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.
В этом протоколе, мы описали нашу процедура катетеризации, коллагеназы перфузии и диссоциации мышиной поджелудочной железы, с целью выделения островков Лангерганса. Технически, наш метод, овладев, должны обеспечивать изоляцию поджелудочной железы в течение 4 мин эвтаназии животных, и на 1 час должно привести к изоляции островков от одного животного. Быстрота методика позволяет выделить из островков до 12 мышей в типичном участке, в результате чего изоляции до 3000 островков.
В отличие от других протоколов, которые используют сырую препаратов коллагеназы, наш протокол имеет использование очищенных протеаз, CI фермента коллагеназы MA и CI фермента протеазы BP. Изменения в последовательности TDE препараты, которые являются коммерчески доступными требует, чтобы каждая партия индивидуально протестирована и оптимизирована до общего использования. Это много-к-много изменчивость привело нас к рассмотрению использования пуриFied TDES от VitaCyte. Эти высокоочищенного TDES характеризуется несколькими методами, включая применение чувствительных флуоресценции меченых анализы подложки. Анализа флуоресценции CDA более чувствительны к различным молекулярным формам коллагеназы, которые имеют различные кинетики в унижающему достоинство родного коллагена. Историческая пептида анализы субстрата дают неполную оценку коллагеназы. Характеризуя коллагеназы несколькими методами обеспечивает большую активность фермента между партиями.
Исходя из нашего внутреннего тестирования с использованием различных препаратов коллагеназы в продаже, мы обнаружили, что очищенный фермент комбинации дал воспроизводимые многие-к-много результатов. Основными преимуществами использования высокой степени очистки и тщательно характеризуется TDES в этом приложении раз оптимальный состав ферментов определен, многие-к-много производительности согласованность гарантирована. Эта согласованность исключает трудоемкий процесс много квалификация обычно требуетсядля продуктов сырая или обогащенные коллагеназы. Очищенный TDES также включить дополнительные изменения состава для улучшения урожайности и качества островки оправился от различных штаммов мыши. Отчетный оптимальных составов ферментов для выделения островков из разных линий мышей можно более эффективно общались. Это, в свою очередь, приводит к более продуктивного использования ресурсов и повышение гибкости в экспериментальном дизайне.
Есть много важных шагов, которые могут повлиять на исход островок изоляции с помощью нашего протокола. Во-первых, это необходимость обеспечения эффективного инфляции поджелудочной железы во время перфузии ферментного препарата. Важно, чтобы начать инфляции с нежной силой на шприце, а также увеличить силу, как поджелудочная железа раздувается. Это полезно для перемещения кишечника и поджелудочной железы поднять во время инфляции, так что коллагеназы perfuses весь орган. Другим важным шагом является силой, с которой трясет труб AfteГ инкубации при 37 ° C (шаг 2,2). Мы обнаружили, что встряхивая поджелудочной железы трудно против крышку трубки вызывает фрагментацию островки, но без какой-либо механической диссоциации на этот шаг, островок урожаи могут резко упасть. Важно также, что на этапе диссоциации со шприцем (шаг 2,5), среднего уровня сила применяется во время перемещения вверх и вниз с поршнем, что обеспечивает адекватное диссоциации ткани, прежде чем этап фильтрации (2,6), где очень мало ткань должна быть сохранена на сетчатый фильтр чая. И, наконец, последний шаг, чтобы внимательно следить является стремление всего 20 мл Histopaque фракционированного островков. Хотя островков, как правило, на стыке Histopaque и HBSS, мы обнаружили, что мы теряем островков, когда мы пытаемся удалить только интерфейс, вместо этого, мы теперь полностью удалить 20 мл использованием большого диаметра 25 мл пипетки. Мы добавили фильтрацию через перевернутый 70 мкм фильтром (шаг 2,11), чтобы устранить необходимость вentrifuge островки несколько раз, чтобы смыть Histopaque.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (как в RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |