マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。
β細胞の遺伝子発現とin vitroでの機能の尋問は、真正面から、げっ歯類の腫瘍形成性細胞株の研究から単離されたげっ歯類の小島の研究に長年にわたってシフトしている。主要な島は、彼らがより忠実に細胞内シグナル伝達経路および分泌応答の生物学を反映していることの明確な利点を提供します。組織解離酵素(TDE)の製剤を用いた膵島分離の方法は、多くの実験室1月4日に設立されているのに対して、任意のげっ歯類の系統から膵島収量と品質の一貫性の変動は、主膵島研究の範囲と実現可能性を制限します。これらの変化はしばしば膵島分離手順で使用される部分的に精製された原油TDESの結果として発生します。頻繁に活動のロット間のばらつきを示し、多くの場合、使用する酵素の投与量の調整が必要になるTDES。レポートの数が少ないの齧歯類の細胞単離のためのTDES 5,6を精製し使用している</supは>が、実際には、ヒト膵島単離のためのTDES、精製の日常的な使用と利点にもかかわらず普及していない。 VitaCyte、LLC(インディアナポリス、インディアナ州)と共同で、我々は、を介して粗組織分画に続いTDESをマウスの膵管に直接灌流されている後藤7,8、、によって記載されたものに基づいて修正されたマウスの膵島単離プロトコルを開発HISTOPAQUE勾配9、および精製された膵島の単離。我々のプロトコルには有意差は、精製されたコラゲナーゼ(CI zyme MA)および中性プロテアーゼ(CI zyme BP)の組み合わせを使用することである。コラゲナーゼは、基板6のように蛍光標識された水溶性の子牛の皮の繊維を利用して6蛍光コラーゲン分解活性(CDA)のアッセイの使用によって特徴づけられた。それは基質として天然コラーゲンに依存しているので、この基板は、組織マトリックスにおけるコラーゲン分解の動力学のより予測です。プロテアーゼはchであった感受性蛍光カイネティックアッセイ10でaracterized。より伝統的な生化学的な分析とともに、これらの改善されたアッセイを活用することでロット間の改良された性能の一貫性につながる、より一貫して製造することTDEを有効にしてください。ここで説明されたプロトコルは、最大限の膵島収量およびC57BL / 6マウスを用いて最適な膵島の形態用に最適化された。このプロトコルの開発時には、コラゲナーゼと中性プロテアーゼのいくつかの組み合わせが異なる濃度で評価し、コラゲナーゼの最終比:35:10の中性プロテアーゼ、シグマXI型に匹敵する酵素の性能を表しています。ラットやマウスの異なる株から平均膵島収量の大幅な変動が報告されているので、TDEの組成物の追加変更は、異なる種や菌株から回収された膵島の収量と品質を向上させるためになされるべきである。
このプロトコルでは、ランゲルハンス島を単離することを目標に、カニュレーション、コラゲナーゼ灌流、及びネズミの膵臓の解離のために私たちの手順を説明してきました。技術的には、我々の方法は、一度マスターして、動物の安楽死の4分以内に膵臓の分離を可能にする必要があり、1時間することで、単一の動物から膵島の分離をもたらすべきである。技術の速さは、それによって3000小島までの分離で、その結果、私たちは典型的なストレッチで12匹までから膵島を分離することができます。
コラゲナーゼの粗調製物を使用する他のプロトコルとは異なり、我々のプロトコルは、精製されたプロテアーゼは、CI zymeコラゲナーゼマサチューセッツおよびCI zyme BPのプロテアーゼの使用を特徴とする。市販されているTDE製剤の一貫性のばらつきは各ロットは個別に一般的に使用する前にテストされ、最適化されている必要があります。このロット間変動は、私たちはプリの使用を考慮するために導いVitaCyteからfied TDES。これらの高度に精製されたTDESは敏感な蛍光標識基質アッセイの使用を含む複数の方法によって特徴づけられる。蛍光CDAのアッセイが劣化天然コラーゲンで異なる動態を持っコラゲナーゼの異なる分子形態の影響を受けやすくなります。歴史的なペプチド基質アッセイは、コラゲナーゼの不完全なアセスメントを提供します。複数のメソッドでコラゲナーゼを特徴付けることはロット間の大きい酵素活性を確実にします。
市販のコラゲナーゼ製剤のさまざまな方法を使って、社内テストに基づいて、我々は、精製酵素の組み合わせが再現可能なロットの結果をもたらしたことがわかった。最適な酵素組成物を定義した後、このアプリケーションで高度に精製され、厳格に特徴付けTDESを使用する主な利点は、ロット間の性能の一貫性が保証されています。この一貫性は、通常必要とされる多くの資格の労働集約的なプロセスを排除原油または濃縮コラゲナーゼ製品の。精製TDESはまた、異なるマウス系統から回収された膵島の収量と品質を向上させるための組成物の追加の変更を有効にしてください。マウスの異なる系統から膵島を分離するための最適な酵素組成物を報告することは、より効果的に伝達することができます。これは、順番に、実験的なデザインのリソースと柔軟性の向上をより生産的な利用につながる。
我々のプロトコルを使用して、膵島単離の結果に影響を与えることができる多くの重要なステップがあります。第一は、酵素製剤の血中に、膵臓の効果的なインフレ率を達成する必要があります。シリンジに優しい力でインフレを起動して、膵臓が膨らむような力を高めることが重要である。それが腸を移動し、コラゲナーゼ全体臓器を灌流ように膨張時に膵臓を持ち上げておくと便利です。もう一つの重要なステップは、1つは、チューブafteを振るする力である37℃(ステップ2.2)において、rはインキュベーション。私たちは、チューブのキャップかたい膵臓を振ると、膵島の断片化が発生しますが、この段階で機械的解離の任意のフォームなしで、膵島収量が劇的に減少することを見出した。それは、シリンジ(ステップ2.5)との解離工程中に、中レベルの力は、プランジャと上下運動中に適用されることも不可欠ですが、これはフィルタリングステップ(2.6)の前に十分な組織解離を保証し、どこに非常に少ない組織は、茶漉しフィルター上に保持されるべきである。最後に、慎重にフォローするための最後のステップは、HISTOPAQUE画し膵島の全体の20ミリリットルの願いです。小島はHISTOPAQUEし、HBSSの界面に典型的であるが、我々は唯一のインタフェースを削除しようとしたとき私たちは島を失うことを発見したのではなく、我々は今、大口径25mlのピペットを使用することで全体の20ミリリットルを削除します。我々は、cに必要性を排除するために反転さ70μmのフィルター(ステップ2.11)を通して濾過を追加しましたHISTOPAQUEを洗い流すために繰り返し膵島をentrifuge。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIHの助成金R01 DK060581、R01 DK083583(RGMの両方)によって部分的にサポートされていました。
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |