Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.
Beta hücre gen ekspresyonu ve in vitro fonksiyon sorgulama dürüstçe kemirgen tümörojenik hücre hatları çalışma izole kemirgen adacıklar çalışması için yılda kaymıştır. Birincil adacıkları daha sadakatle hücre içi sinyal yolları ve sekretuar yanıtları biyoloji yansıtan ayrı bir avantaj sunuyoruz. Doku dissociating enzim (TDE) preparatlarını kullanan adacık izolasyon yöntemi de birçok laboratuvarlarında 1-4 kurulmuştur Oysa, herhangi bir kemirgen gerginlik adacık verim ve kalite tutarlılığı farklılıklar ölçüde ve birincil adacık çalışmalar fizibilite sınırlayabilir. Bu varyasyonlar, sık sık adacık izolasyon prosedüründe kullanılan ham kısmen saflaştırılmış TDES bir sonucu olarak ortaya çıkar; sık sık aktivitesi çok arası çok varyasyonları gösteren ve sık sık kullanılan enzim doz ayarlamaları gerektirir TDES. Raporlar az sayıda kemirgen hücre izolasyonları için TDES 5, 6 saflaştırılmış kullanmış </sup>, ama pratikte insan adacık izolasyonları için TDES saflaştırılmış rutin kullanımı ve avantajları rağmen yaygın değildir. VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) ile işbirliği içinde, biz yoluyla ham doku fraksiyonasyon takip TDES farelerin pankreatik kanal içine doğrudan perfüze edildiği Gotoh 7, 8, tarafından tarif dayalı bir modifiye fare adacık izolasyonu protokolü geliştirdi Bir Histopaque gradiyent 9, ve adacıklar saflaştırılmış izolasyonu. Bizim protokol anlamlı bir fark saflaştırılmış kollajenaz (CI zyme MA) ve nötr proteaz (CI zyme BP) kombinasyonunun kullanımıdır. Kollajenaz substrat 6 olarak floresan etiketli çözülebilir buzağı cilt fibrillerin yararlanılan 6 floresans kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) testinin kullanımı ile karakterize edilmiştir. Bu substrat olarak yerli kollajen dayanır çünkü bu substrat doku matriksinin kollajen bozunma kinetiği daha prediktif olduğunu. Proteaz CH olduğuhassas bir floresan kinetik yöntemde 10 ile aracterized. Daha geleneksel biyokimyasal analizi ile birlikte bu gelişmiş testlerin kullanılması TDE lotlar arasında gelişmiş performans tutarlılığı yol daha tutarlı üretilmesini sağlayacak. Burada açıklanan protokol C57BL / 6 fareler kullanılarak maksimal adacık verimi ve en uygun adacık morfoloji için optimize edilmiştir. Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, kollajenaz ve nötral proteazların çeşitli kombinasyonları farklı konsantrasyonlarda değerlendirilmektedir ve kollajenaz nihai oranı edildi: 35:10 nötral proteaz Sigma Tip XI karşılaştırılabilir enzim performansını gösterir. Sıçan ve farelerin farklı suşları ortalama adacık verimlerinde önemli değişkenlik bildirilmiştir Çünkü, TDE kompozisyonun ek değişiklikler farklı tür ve suşlarının kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için yapılmalıdır.
Bu protokol, Langerhans adacıkları izole amacı ile, kanülasyon, kollajenaz perfüzyon ve fare pankreas ayrışması için prosedürü tarif var. Teknik olarak, bizim yöntemi, bir kez hakim, hayvan ötenazi 4 dk içinde pankreas izolasyonu için izin vermeli, ve 1 saat tek bir hayvandan adacık izolasyonu sonuçlanmalıdır. Tekniğin hız bize böylece 3.000 adacıklar için bir izolasyon ile sonuçlanan kadar, tipik bir streç 12 fareler için adacıkları izole etmek için olanak sağlar.
Kollajenaz ham preparatları kullanan diğer protokoller aksine, bizim protokol saflaştırılmış proteazlar, CI zyme Kollajenaz MA ve CI zyme BP Protease kullanımı sunmaktadır. Ticari olarak temin edilebilirler TDE preparatlar tutarlılık varyasyonlar her bir çok ayrı ayrı genel kullanım öncesinde test edilmiş ve optimize edilmiş olmasını gerektirir. Bu çok-to-çok değişkenlik bize puri kullanımı dikkate yol açtıVitaCyte dan ğı TDES. Bunlar, yüksek oranda saflaştırılmış TDES duyarlı fluoresan etiketli substrat testlerinin kullanılması da dahil olmak üzere birden fazla yöntem ile karakterize edilir. Floresans CDA tahlil aşağılayıcı yerli kollajen farklı kinetik var kollajenaz farklı moleküler formları daha duyarlıdır. Tarihsel peptid substrat testlerinin kollajenaz tamamlanmamış bir değerlendirmesini sağlar. Birden yöntemlerle kollajenaz niteleme sürü arasında büyük enzim aktivitesi sağlar.
Piyasada bulunan kollajenaz hazırlıkları çeşitli kullanarak bizim in-house test dayanarak, saflaştırılmış enzim kombinasyonları tekrarlanabilir sürü-için-lot sonuçları verdiğini bulundu. Bu uygulama son derece saf ve titizlikle karakterize TDES kullanmanın önemli avantajları kez Optimum enzim yapısı tanımlanmaktadır olan, çok-to-lot performans tutarlılığı sağlanır. Bu tutarlılık normalde gerekli yeri yeterlilik emek yoğun bir süreç ortadan kaldırırham veya zenginleştirilmiş kollajenaz ürünler için. Saflaştırılmış TDES da farklı fare suşları kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için kompozisyonun ek değişiklikleri etkinleştirmek. Farelerin farklı suşları adacık izolasyonu için optimum enzim bileşimler, raporlanması daha etkili bir şekilde iletişim olabilir. Bu da, kaynaklar ve deneysel tasarım geliştirilmiş esneklik daha verimli kullanımına yol açmaktadır.
Bizim protokolü kullanılarak adacık izolasyonların sonucunu etkileyebilecek birçok kritik adımlar vardır. Birinci enzim hazırlanması perfüzyon sırasında pankreas etkili şişirme elde etmek için ihtiyaç vardır. Bu şırınga üzerine nazik bir güçle enflasyon başlatın ve pankreas açılırsa olarak kuvvetini artırmak için önemlidir. Bu bağırsak hareket ve kollajenaz tüm organı perfuses böylece enflasyonun sırasında pankreas kaldırmak için yardımcı olur. Başka kritik adım biri tüpler afte sallar hangi ile güçtür37 ° C (adım 2.2) de r inkübasyon. Bu tüp kapak karşı sert pankreas sallama adacık parçalanma neden olur, ancak bu aşamada mekanik ayrışma herhangi bir biçimde, adacık verimleri önemli ölçüde düşmesi bulduk. Bu şırınga (adım 2.5) ile ayrışma basamağı sırasında, bir orta-düzey kuvvet ile piston yukarı ve aşağı doğru hareketi sırasında uygulanan da çok önemlidir, bu filtreleme adımı (2.6) daha önce yeterli doku çözünme sağlar, burada çok az doku çay süzgeci filtre üzerinde saklanmalıdır. Son olarak, dikkatle takip etmek son adım histopaque fraksiyone adacık genelinde 20 ml aspirasyon olduğunu. Adacıklar histopaque ve HBSS ve arayüzü tipik olmasına rağmen, biz sadece arayüz kaldırmaya çalıştığınızda biz adacıklar kaybetmek bulduk, bunun yerine, artık büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak tüm 20 ml çıkarın. Biz c ihtiyacını ortadan kaldırmak için ters 70 mikron filtre (adım 2.11) aracılığıyla filtrasyon eklendihistopaque uzak yıkamak için art arda adacıklar entrifuge.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibe R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM hem) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |