Summary
Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.
Abstract
Beta hücre gen ekspresyonu ve in vitro fonksiyon sorgulama dürüstçe kemirgen tümörojenik hücre hatları çalışma izole kemirgen adacıklar çalışması için yılda kaymıştır. Birincil adacıkları daha sadakatle hücre içi sinyal yolları ve sekretuar yanıtları biyoloji yansıtan ayrı bir avantaj sunuyoruz. Doku dissociating enzim (TDE) preparatlarını kullanan adacık izolasyon yöntemi de birçok laboratuvarlarında 1-4 kurulmuştur Oysa, herhangi bir kemirgen gerginlik adacık verim ve kalite tutarlılığı farklılıklar ölçüde ve birincil adacık çalışmalar fizibilite sınırlayabilir. Bu varyasyonlar, sık sık adacık izolasyon prosedüründe kullanılan ham kısmen saflaştırılmış TDES bir sonucu olarak ortaya çıkar; sık sık aktivitesi çok arası çok varyasyonları gösteren ve sık sık kullanılan enzim doz ayarlamaları gerektirir TDES. Raporlar az sayıda kemirgen hücre izolasyonları için TDES 5, 6 saflaştırılmış kullanmış 7, 8, tarafından tarif dayalı bir modifiye fare adacık izolasyonu protokolü geliştirdi Bir Histopaque gradiyent 9, ve adacıklar saflaştırılmış izolasyonu. Bizim protokol anlamlı bir fark saflaştırılmış kollajenaz (CI zyme MA) ve nötr proteaz (CI zyme BP) kombinasyonunun kullanımıdır. Kollajenaz substrat 6 olarak floresan etiketli çözülebilir buzağı cilt fibrillerin yararlanılan 6 floresans kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) testinin kullanımı ile karakterize edilmiştir. Bu substrat olarak yerli kollajen dayanır çünkü bu substrat doku matriksinin kollajen bozunma kinetiği daha prediktif olduğunu. Proteaz CH olduğuhassas bir floresan kinetik yöntemde 10 ile aracterized. Daha geleneksel biyokimyasal analizi ile birlikte bu gelişmiş testlerin kullanılması TDE lotlar arasında gelişmiş performans tutarlılığı yol daha tutarlı üretilmesini sağlayacak. Burada açıklanan protokol C57BL / 6 fareler kullanılarak maksimal adacık verimi ve en uygun adacık morfoloji için optimize edilmiştir. Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, kollajenaz ve nötral proteazların çeşitli kombinasyonları farklı konsantrasyonlarda değerlendirilmektedir ve kollajenaz nihai oranı edildi: 35:10 nötral proteaz Sigma Tip XI karşılaştırılabilir enzim performansını gösterir. Sıçan ve farelerin farklı suşları ortalama adacık verimlerinde önemli değişkenlik bildirilmiştir Çünkü, TDE kompozisyonun ek değişiklikler farklı tür ve suşlarının kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için yapılmalıdır.
Protocol
A. Malzeme İhtiyaç: Tablo 1 (reaktifleri) Bkz hazırlanmasından önceki
- HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 +% 1 penisilin / streptomisin (buzdolabında saklanan veya buz üzerinde tutulmalıdır).
- % 20 BSA stok su içinde yapılmış ve bölünüp ve -20 ° C'de depolanır
- HBSS (BSA): 1X 200 ml HBSS (P / S)% 20 BSA + 3 ml (nihai konsantrasyonlar BSA,% 0.3 'tür)
- Adacık orta: RPMI +% 10 FBS +% 1 glutamin +% 1 penisilin / streptomisin
- Histopaque 1100: 1119, 240 ml Histopaque + 200 mL 1077 Histopaque
- 4-0 Sütür (McKesson): 2 ¾ inç parçalar halinde kesilir ve 10 cm Petri saklanır
- Araçlar: 90 ° Güzel Bilim Araçları forseps bükün ve forseps her üç çift dişli diş aşağı dosya. Amacınız onları kaldırmak için değil, sıkıcı dişleri için.
- Kollajenaz / proteaz karışımı yönetimi için Kanül: 27G ½ iğne inç, 30 ½ inçiğne, PE50 boru parçaları 12 inç kesti. Keskin kenarları yumuşak bir yuvarlak sonuna kadar her iki iğne aşağı Dosya. PE50 boru parçası içeri bir 12 bir ucunun içine 27G iğne takın. Kasa dönüm, bir pense ile gövde kırarak kasasından 30G iğne çıkarın ¼ her zaman açın. Kasasından pense ile iğne çıkarın ve diseksiyon mikroskop altında PE50 boru diğer ucunu takın. Eğer PE50 boru içine iğne eklemek gibi tüp bükmeyiniz emin olun. 27G iğne Eğer kollajenaz şırınga takmak olacağı sonudur.
- Kollajenaz (CI zyme MA) ve Nötr Proteaz (CI zyme BP). Üreticinin talimatlarına göre sulandırın TDE. Enzim aktivitesi konsantrasyonu hesaplamak için Analiz sürü belirli Sertifikası bakın. Sulandırılan kollajenaz 350,000 kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) birimleri ve reconstit 100.000 nötral proteaz adet toplam aktarınuted BP konik bir tüp içine Proteaz ve HBSS 15 ml'den (P / S) kadar seyreltmek
B. Adım Adım Protokolü
1. Kollajenaz / Proteaz Karışımı ile Pankreas Enflasyon
- Servikal dislokasyon ile fare Euthanize,% 70 EtOH, herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile tamamen anüsten diyafram açık karın boşluğu ile fare gövde doyurabilecek.
- Bir diseksiyon mikroskobu platformu üzerinde fare yerleştirin.
- Çekum ve çıkan kolon çekin ve sol vücut boşluğuna dışında onları ayarlayın. Aşağıdaki adımlar bir özeti için Şekil 1'e bakınız.
- Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açıksa orada kalmalıdır. Hepatik arter, portal ven ve kavisli bir forseps ile onikiparmak kavrayarak karaciğere giden safra kanalı paket bulun. Kavisli bir forseps bir çift ile, arter, ven altına ulaşarak, ve kanal metndle ve arter, ven, safra kanalı altında 4-0 sütür parçası içeri ¾ 2 çekin ve bir kez kravat ve mümkün olduğunca karaciğer yakın sıkı çekin.
- Kavisli bir forseps iki çift kullanarak, dikkatle duodenum kapmak ve papillada duodenuma bağlı safra kanalı bulabilirsiniz. Papilla için safra kanalı yakın altında pankreas ve bağ dokusu hakkı yoluyla poke forseps bir maşa kullanın. Bir delik yapmak organı aracılığıyla hızla forseps Poke ve sonra forseps hem maşa aracılığıyla koymak ve 4-0 sütür başka 2 ¾ inç parça kapmak yoluyla ve kravat kez ve küçük bir daire için çekin, ama sıkı çekmeyin.
- 90 ° forseps ve Superfine Vannas makas değiştirin. 90 ° forseps ile dikkatlice tutun ve safra kanalı gergin olana kadar ince bağırsak çekin. Bağırsak içine açık makas bıçaklama ve sonra bir hareket ile keserek makasla papilla çapında bir yatay kesim olun. Sadece o yapmaya çalışınne papilladan koledok oradan çıkarmadan papilla genelinde kesti.
- Hala 90 ° forseps ile bağırsak tutarken, safra yolu uzunluğunun yarısı kadar safra kanalı içine kanül takın ve ardından yavaşça kanülün etrafında sıkı dikiş çekin.
- Kollajenaz / proteaz karışımı 2.0 ml 3 ml şırınga doldurun ve yavaş, sabit bir hızda kanül içine enjekte edilir.
- Pankreasın enflasyon tamamlandıktan sonra, safra kanalı arasından kanül kaldırmak ve inen kolon başlayan ve bağırsak yukarı çekin gibi bağ dokusu kırpma tarafından şişirilmiş pankreas kaldırmak için kavisli bir forseps ve kavisli makas makas kullanın. Eğer safra kanalı ulaşana kadar bağırsak, pankreas kaldırmak için devam, sonra, dalak, mide, pankreas kaldırmak ve sonra karın boşluğu organları gelen. Sütürler uzak kırpma kaldırarak bitirin. HBSS 5 ml içeren 50 ml'lik bir tüpe pankreas ekleme(P / S). Bu boru, buz üzerinde olmalıdır.
- Dört hayvanlara her hayvan için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. En iyi sonuçlar için, tek seferde sadece dört pancreata çözerler. Ilk dört 37 ° C su banyosu içinde iken Tipik olarak, bir başka dört pancreata şişirmek.
2. Pankreas Ayrılma
- 15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine pancreata ihtiva eden 50 ml'lik tüplere yerleştirin.
- Yavaşça tüp kaya ve doku disosiyasyon kontrol için kapağı tarafından tüpü tutarak iken doku tüpler girdap sonra kolayca ayrı 12 kez gelir emin olun.
- Bir dakika boyunca 290 xg'de en fazla 30 HBSS (BSA) (bu adım için santrifüj tüpleri dengelemek için gerekli olan ne kadar bağlı olarak, daha düşük bir miktar olabilir) ml ve santrifüj ekleyin.
- Süpernatant dikkatlice aspire ve hücre peleti bozmayacak şekilde alt süpernatant (2-3 ml) küçük bir miktar bırakın.
- 30 ml şırınga attac kullanma14G iğne hed, HBSS (BSA) ve en fazla 10 ml ekleyin ve 2 kez aşağı süspansiyon aspirat ve.
- 50 ml'lik bir tüp içine plastik bir çay süzgeci yoluyla hücre karışımı süzün ve başka bir 10 ml HBSS (BSA) ile yıkayın.
- 2 dakika süreyle 330 xg'de santrifüjleyin.
- Durusu süpernatant ve 1 dakika için bir emici kağıt havlu üzerine drenaj boruları ters.
- 10 ml soğuk 1100 histopaque her bir tüp içinde yeniden süspanse edin.
- 10 ml HBSS (BSA) ile histopaque kaplaması ve 18 dakika için 900 x g'da santrifüjlenir.
- Büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak süpernatant genelinde 20 ml çıkarın ve filtre ters 70 mikron ile süpernatant geçmek.
- Yemeğin üzerine sağ tarafı yukarıda tutarak filtre ile 10 ml adacık medya pipetleme 10 cm Petri kabı içine adacıklar durulayın.
- Deney için hazır olana kadar bir kültür 37 ° C'de,% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe islets. Tipik olarak, adacık el-aldı ve önceki exper kadar saydımimentation.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Islet verimleri, morfolojisi ve kalitesi adacık izolasyonu başarı yargılamak için kullanılan genel parametrelerdir. Bizim eller, ortalama C57BL / 6 fare adacık verimleri bu protokolü (bkz. Tablo 2) kullanılarak 150-250 adacıklar aralığında ve optimize Sigma tip XI kollajenaz kullanılarak elde edilen veriler karşılaştırılabilir. Ancak, verimleri kullanılan fare zorlanma ve fare yaşına bağlı olarak değişebilir. Biz istihdam hayvanların çoğu 8-16 hafta yaş aralığındaki Bu protokol C57BL / 6 (180-250 adacıklar / fare), CD1 (200-300 adacıklar / fare), 129 / dahil olmak üzere, birden fazla fare suşları üzerinde test edilmiştir vardır B6 (200-300 adacıklar / fare), BLKS-db/db (120-200 adacıklar / fare), NOD (10 haftalık, 100-150 adacıklar / fare), ve NOD-SCID (100-150 adacıklar / fare ). Tipik adacık morfolojisi (adacık nispeten homojen bir boyut ile şekil dikdörtgen bir yuvarlak sahip olduğu, Şekil 2 'de gösterilen boyut UNIF rağmenormity) zorlanma gerginlik değişebilir. Şekil 3 saflaştırılmış TDES vs Sigma tipi XI kollajenaz ile C57BL / 6 fare izole adacıklar glikoz ile uyarılan insülin salgısının bizim tipik analizini gösterir. Tipik olarak, 2.5 mM glikoz de gözlenenden daha 6-20 kat daha fazla olan, 25 mM glikoz bir insülin uyarım yüksek kaliteli adacık hazırlama sonuçlanır. Diğer uygulamalar da izole adacıklar kalitesini test etmek için kullanılan ve bu perifusion teknikler, diğerleri arasında 11. Ca2 + görüntüleme (Fura2 ile) ve ters transkripsiyon-PCR kullanılması dahil edilebilir.
Şekil 1. Koledok kanülasyonu bir özeti.
Şekil 2. 24 saat aşağıdaki yalıtımı konusunda C57BL / 6 adacıktan tipik görünümü. Görüntüler içinde yakalanmaları40X büyütmede verted mikroskop.
Şekil 3,. C57BL / 6 adacık glukoz-uyarılmış insülin salgılanması. 24 saat aşağıdaki izolasyon olarak, 100 adacıkları 37 2.5 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer ° C HEPES-tamponlu çözelti, 1 saat boyunca bir 12-kuyu çanak içinde inkübe edildi. Adacıkları ardından iki sitenin immunospecific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Kristal Kimya) kullanarak süpernatant insülin ölçümü için toplandı sonra ek bir saat için 2.5 mM glukozun Krebs-Ringer HEPES aktarılmıştır. Aynı Adacıklar daha sonra 25 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer HEPES-tamponlu çözelti ile transfer edildi ve ortam içine insülin salınması inkübasyondan 1 saat sonra ELISA ile ölçülmüştür.
Discussion
Bu protokol, Langerhans adacıkları izole amacı ile, kanülasyon, kollajenaz perfüzyon ve fare pankreas ayrışması için prosedürü tarif var. Teknik olarak, bizim yöntemi, bir kez hakim, hayvan ötenazi 4 dk içinde pankreas izolasyonu için izin vermeli, ve 1 saat tek bir hayvandan adacık izolasyonu sonuçlanmalıdır. Tekniğin hız bize böylece 3.000 adacıklar için bir izolasyon ile sonuçlanan kadar, tipik bir streç 12 fareler için adacıkları izole etmek için olanak sağlar.
Kollajenaz ham preparatları kullanan diğer protokoller aksine, bizim protokol saflaştırılmış proteazlar, CI zyme Kollajenaz MA ve CI zyme BP Protease kullanımı sunmaktadır. Ticari olarak temin edilebilirler TDE preparatlar tutarlılık varyasyonlar her bir çok ayrı ayrı genel kullanım öncesinde test edilmiş ve optimize edilmiş olmasını gerektirir. Bu çok-to-çok değişkenlik bize puri kullanımı dikkate yol açtıVitaCyte dan ğı TDES. Bunlar, yüksek oranda saflaştırılmış TDES duyarlı fluoresan etiketli substrat testlerinin kullanılması da dahil olmak üzere birden fazla yöntem ile karakterize edilir. Floresans CDA tahlil aşağılayıcı yerli kollajen farklı kinetik var kollajenaz farklı moleküler formları daha duyarlıdır. Tarihsel peptid substrat testlerinin kollajenaz tamamlanmamış bir değerlendirmesini sağlar. Birden yöntemlerle kollajenaz niteleme sürü arasında büyük enzim aktivitesi sağlar.
Piyasada bulunan kollajenaz hazırlıkları çeşitli kullanarak bizim in-house test dayanarak, saflaştırılmış enzim kombinasyonları tekrarlanabilir sürü-için-lot sonuçları verdiğini bulundu. Bu uygulama son derece saf ve titizlikle karakterize TDES kullanmanın önemli avantajları kez Optimum enzim yapısı tanımlanmaktadır olan, çok-to-lot performans tutarlılığı sağlanır. Bu tutarlılık normalde gerekli yeri yeterlilik emek yoğun bir süreç ortadan kaldırırham veya zenginleştirilmiş kollajenaz ürünler için. Saflaştırılmış TDES da farklı fare suşları kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için kompozisyonun ek değişiklikleri etkinleştirmek. Farelerin farklı suşları adacık izolasyonu için optimum enzim bileşimler, raporlanması daha etkili bir şekilde iletişim olabilir. Bu da, kaynaklar ve deneysel tasarım geliştirilmiş esneklik daha verimli kullanımına yol açmaktadır.
Bizim protokolü kullanılarak adacık izolasyonların sonucunu etkileyebilecek birçok kritik adımlar vardır. Birinci enzim hazırlanması perfüzyon sırasında pankreas etkili şişirme elde etmek için ihtiyaç vardır. Bu şırınga üzerine nazik bir güçle enflasyon başlatın ve pankreas açılırsa olarak kuvvetini artırmak için önemlidir. Bu bağırsak hareket ve kollajenaz tüm organı perfuses böylece enflasyonun sırasında pankreas kaldırmak için yardımcı olur. Başka kritik adım biri tüpler afte sallar hangi ile güçtür37 ° C (adım 2.2) de r inkübasyon. Bu tüp kapak karşı sert pankreas sallama adacık parçalanma neden olur, ancak bu aşamada mekanik ayrışma herhangi bir biçimde, adacık verimleri önemli ölçüde düşmesi bulduk. Bu şırınga (adım 2.5) ile ayrışma basamağı sırasında, bir orta-düzey kuvvet ile piston yukarı ve aşağı doğru hareketi sırasında uygulanan da çok önemlidir, bu filtreleme adımı (2.6) daha önce yeterli doku çözünme sağlar, burada çok az doku çay süzgeci filtre üzerinde saklanmalıdır. Son olarak, dikkatle takip etmek son adım histopaque fraksiyone adacık genelinde 20 ml aspirasyon olduğunu. Adacıklar histopaque ve HBSS ve arayüzü tipik olmasına rağmen, biz sadece arayüz kaldırmaya çalıştığınızda biz adacıklar kaybetmek bulduk, bunun yerine, artık büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak tüm 20 ml çıkarın. Biz c ihtiyacını ortadan kaldırmak için ters 70 mikron filtre (adım 2.11) aracılığıyla filtrasyon eklendihistopaque uzak yıkamak için art arda adacıklar entrifuge.
Disclosures
NDS, SAT ve RGM ifşa hiçbir şeyim yok. Yazar AGB VitaCyte tarafından istihdam edilmektedir. Yazar RCM VitaCyte bir mülkiyet çıkarı vardır.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM hem) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
|||||||||||
References
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
