En detaljerad beskrivning av mus ö isolering beskrivs användning av tekniken av in situ pankreas duktal kanylering och perfusion av en kombination av renat kollagenas och neutralt proteas.
Förhören av beta-cell genuttryck och funktion in vitro har rakt skiftat under åren från studien av cell gnagare tumorogena linjer till studiet av isolerade gnagare holmar. Primära öar erbjuder den distinkta fördelen att de mer rättvisande bild biologi intracellulära signalvägar och svar sekretoriska. Metoden för ö isolering med vävnad dissocierande enzym (TDE) preparat har väl etablerad i många laboratorier 1-4, variationer i konsistensen av ö avkastning och kvalitet från en viss gnagare stam begränsa omfattningen och genomförbarheten av primära ö studier. Dessa variationer förekommer ofta som ett resultat av de råa delvis renade TDES används i ö isoleringsförfarandet, TDES ofta uppvisar mycket till parti variationer i aktivitet och kräver ofta justeringar av dosen enzym som används. Ett litet antal rapporter har använt renade TDES för isoleringar gnagarcellinjer 5, 6 </sup>, men praxis är inte utbredd trots rutinmässig användning och fördelar av renade TDES för mänskliga ö isolering. I samarbete med VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), utvecklade vi ett modifierat musprotokollet holme isolering baserad på det som beskrivs av Gotoh 7, 8, i vilken TDES är perfuseras direkt i pankreas kanalen hos möss, följt av råolja vävnad fraktionering genom en Histopaque lutning 9, och isolering av renade öar. En signifikant skillnad i vår protokoll är användningen av renat kollagenas (Cl zyme MA) och neutralt proteas (Cl zyme BP) kombination. Den kollagenas kännetecknas av användningen av en 6 fluorescens kollagen nedbrytande aktivitet (CDA) analys som utnyttjade fluorescensmärkta lösliga fibriller kalvskinn som substrat 6. Detta substrat är mer förutsägande av kinetiken för kollagennedbrytning i vävnadsmatrisen eftersom det bygger på nativt kollagen som substrat. Proteaset var characterized med en känslig fluorescerande kinetisk analys 10. Med hjälp av dessa förbättrade analyser tillsammans med mer traditionella biokemisk analys möjliggöra TDE skall tillverkas mer konsekvent, vilket leder till förbättrad prestanda överensstämmelse mellan partier. Protokollet som beskrivs här var optimerad för maximal holme avkastning och optimal holme morfologi med C57BL / 6 möss. Under utvecklingen av detta protokoll har flera kombinationer av kollagenas och neutrala proteaser utvärderades olika koncentrationer, och den slutliga förhållandet kollagenas: neutralt proteas av 35:10 representerar enzym prestanda jämförbar med Sigma typ XI. Eftersom betydande variabilitet i genomsnittliga holme avkastningen från olika stammar av råttor och möss har rapporterats bör ytterligare modifieringar av TDE sammansättningen göras för att förbättra utbytet och kvaliteten på öar som återvunnits från olika arter och stammar.
I detta protokoll, har vi beskrivit vår procedur för kanylering kollagenas perfusion, och dissociation av den murina pankreas, med målet att isolera de Langerhanska öarna. Tekniskt vår metod, en gång bemästrat, bör medge bukspottkörteln isolering inom 4 minuter efter euthanizing djuret och med 1 timme bör resultera i isolering av öar från ett enda djur. Snabbheten av tekniken tillåter oss att isolera öar från upp till 12 möss vid en typisk sträck, vilket resulterar i isolering av upp till 3.000 öar.
Till skillnad från andra protokoll som använder råa beredningar av kollagenas, har vår protokoll att använda renade proteaser, CI zyme kollagenas MA och CI zyme BP proteas. Variationer i konsistens TDE preparat som är kommersiellt tillgängliga kräver att varje del för sig testas och optimeras innan allmän användning. Denna vara till mycket variation fick oss att anse att användningen av purirade TDES från VitaCyte. Dessa högrenade TDES kännetecknas av flera metoder inklusive användning av känsliga märkta fluorescens substrat analyser. Fluorescensen CDA analysen är mer känsliga för olika molekylära former av kollagenas som har olika kinetik i förnedrande nativt kollagen. Historiska peptidsubstrat analyser ger en ofullständig bedömning av kollagenas. Karakterisera kollagenas av flera metoder ger större enzymaktivitet mellan partier.
Baserat på vår egen test med hjälp av olika kollagenas preparat kommersiellt tillgängliga, fann vi att de renade enzymkombinationer gav reproducerbara parti till parti resultat. De stora fördelarna med att använda höggradigt renade och noggrant karaktäriseras TDES i denna ansökan en gång är den optimala enzymkompositionen definieras, är mycket till parti prestanda konsistens garanteras. Denna konsekvens eliminerar arbetskrävande process parti kvalifikationer som normalt krävsför råolja eller berikad kollagenas produkter. Renade TDES möjliggör också ytterligare modifieringar av sammansättningen för att förbättra avkastningen och kvaliteten på öar som återvunnits från olika musstammar. Rapportering optimala enzymkompositioner för isolering av öar från olika stammar av möss kan vara mer effektivt kommuniceras. Detta i sin tur leder till mer produktiv användning av resurser och en förbättrad flexibilitet i experimentell design.
Det finns många viktiga steg som kan påverka resultatet av ö isoleringar med vår protokollet. Den första är behovet av att uppnå en effektiv inflationen i bukspottkörteln under perfusionen av enzympreparatet. Det är viktigt att börja med inflationen mild kraft på sprutan, och öka kraften som bukspottkörteln blåses. Det är till hjälp att flytta tarmarna och lyft bukspottkörteln under uppblåsning så att kollagenas perfuses hela organet. En annan kritisk steg är den kraft med vilken en skakar rören afteR inkubation vid 37 ° C (steg 2,2). Vi har funnit att skaka bukspottkörteln hårt mot locket på tuben orsakar fragmentering av öar, men utan någon form av mekanisk dissociation i detta steg kan holme avkastning falla dramatiskt. Det är också viktigt att under dissociationssteget med sprutan (steg 2,5), en medelhög nivå kraft som appliceras under upp och ner rörelse med kolven, vilket ger tillräcklig vävnadsdissociering före filtreringssteget (2,6), där mycket lite vävnad bör behållas på tesil filtret. Slutligen är det sista steget för att följa noga strävan av hela 20 ml av HISTOPAQUE fraktionerade holmar. Även holmar är vanligtvis i gränssnittet för HISTOPAQUE och HBSS, har vi funnit att vi förlorar öar när vi försöker ta bort endast gränssnittet, utan vi nu ta bort hela 20 ml med en stor borrning 25 ml pipett. Vi har lagt till filtrering genom den inverterade 70 pm filter (steg 2,11) för att eliminera behovet av till centrifuge öarna flera gånger för att tvätta bort HISTOPAQUE.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag R01 DK060581, R01 DK083583 (både RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |