Summary
Un
Abstract
È noto che i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (CNS) non può rigenerare loro assoni dopo lesioni per diminuita capacità intrinseca di supportare la crescita assonale e un ambiente ostile in 1,2 maturo CNS. Al contrario, i neuroni maturi nel sistema nervoso periferico (PNS) rigenerare facilmente dopo lesioni 3. Adulti dei gangli della radice dorsale (DRG) i neuroni sono ben noti per rigenerare robusto dopo lesioni dei nervi periferici. Ogni neurone DRG cresce uno assone dal soma cellulare, che si dirama in due rami assonali: un ramo periferico innerva bersagli periferici e un ramo centrale che si estende nel midollo spinale. Lesioni dei DRG risultati assoni periferici nella rigenerazione degli assoni sostanziale, mentre gli assoni centrali nel midollo spinale rigenerare poco dopo la lesione. Tuttavia, se la lesione assonale periferico si verifica prima della lesione del midollo spinale (un processo chiamato la lesione condizionamento), rigenerazione di assoni centrali è greatly migliorata 4. Inoltre, gli assoni dei neuroni centrali DRG condividono lo stesso ambiente ostile come discendente assoni corticospinali nel midollo spinale. Insieme, si ipotizza che i meccanismi molecolari che controllano la rigenerazione degli assoni dei neuroni DRG adulti può essere sfruttata per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC. Come risultato, i neuroni DRG adulti vengono ora ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la crescita assonale rigenerativa 5-7.
Qui si descrive un metodo di coltura adulto DRG neurone che possono essere utilizzati per lo studio della rigenerazione assonale genetica in vitro. In questo modello i neuroni DRG adulti sono geneticamente manipolati tramite elettroporazione trasfezione mediata gene 6,8. Trasfettando neuroni con DNA plasmidico o SI / shRNA, questo approccio permette sia di guadagni e perdite di funzione esperimenti per studiare il ruolo di ogni gene d'interesse in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. Quando i neuroni sono trasfettate con SI / shRNA, la proteina endogena è miratadi solito dopo 3-4 giorni impoverito nella cultura, durante i quali il tempo robusta crescita degli assoni è già verificato, rendendo la perdita di funzione studi meno efficace. Per risolvere questo problema, il metodo qui descritto comprende una risospensione e ri-placcatura passo dopo trasfezione, che permette di assoni ricrescere dai neuroni in assenza della proteina mirata. Infine, forniamo un esempio di utilizzo di questo modello in vitro per studiare il ruolo di un gene associato rigenerazione degli assoni, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dei neuroni DRG da adulto 9.
Protocol
1. Preparazione di vetrini coprioggetti, terreno di coltura, e enzimi digestivi
- Il 12-mm tondo # 1 vetrini vengono utilizzati per la coltura neuronale. Le coprioggetti vengono puliti con il 10% HCL notte seguito da lavaggio ad ultrasuoni con acqua distillata deionizzata e per 3 volte (20 minuti / tempo). Le coprioggetti puliti sono memorizzati in etanolo 70% per un uso futuro. Prima di ogni sperimentazione, i coprioggetti sono dotate di aria essiccata e inseriti nella piastra di coltura.
- Per rivestire le coprioggetti secchi, 100 pl di soluzione di rivestimento contenente 100 pg / ml di poli-D-lisina e 10 ug / ml soluzione laminina lavoro viene aggiunto su ciascun vetrino coprioggetto e la piastra di coltura viene trasferita in un incubatore a 37 ° C. Dopo 1-2 ore, la soluzione di rivestimento viene rimosso e le coprioggetti sono lavate 3 volte con PBS sterile 1X.
- Per preparare il terreno di coltura, il terreno minimo essenziale (MEM) è integrato con 5% siero bovino fetale (FBS), 1X soluzione di penicillina-streptomicina (500 unità di penicillinalin e 500 pg di streptomicina), 1X Glutamax-integratore I, ed i reagenti antimitotici contenente 20 pM 5-fluoro-2-desossiuridina e 20 pM uridina (FDU / R). Per il terreno privo di siero, il FBS è sostituito con il supplemento B27.
- La collagenasi Una soluzione viene preparata sciogliendo collagenasi A polvere con MEM per fare una concentrazione operativa di 1 mg / ml. Per la tripsina, il Triplo 1X Express viene utilizzato.
2. Dissezione e Raccolta di neuroni adulti mouse DRG
- Dopo l'eutanasia 6 - al topo adulto a 10 settimane di età, togliere la pelle dorsale e tagliare l'intera colonna vertebrale. Lavare la colonna vertebrale rimosso con 1 x PBS 2-3 volte.
- Pin rimossa la colonna vertebrale alla piastra dissezione con un massimo lato ventrale, e rimuove accuratamente i muscoli per esporre i nervi sensoriali sotto un microscopio da dissezione. I nervi collegati al DRG a livello di legname sono la più grossa e facili da individuare. Pertanto, solo per la maggior parte degli esperimenti lombareDRG vengono raccolte.
- Tagliare ogni vertebra lungo la linea centrale con le forbici piccole e rimuovere con attenzione i dischi intervertebrali. Utilizzo di pinze per dividere ogni vertebra per esporre il midollo spinale.
- Per sezionare i DRG legname, sollevare ogni nervo legname con una pinza e risalire verso il midollo spinale per individuare i DRG associati lombari (da L1 a L6).
- Tagliare ciascun DRG da allegato nervi periferici, radici dorsali e ventrali con le forbici a molla, e conservarla in provetta per microcentrifuga con mezzo MEM posti su ghiaccio. Più DRG a diversi livelli spinali (ad esempio DRG toracica) possono essere sezionati in modo simile quando necessario.
3. Digestione e dissociazione dei neuroni adulti mouse DRG
- Dopo aver raccolto tutti i DRG sezionati, sostituire il mezzo MEM con 1 ml di una soluzione di collagenasi e incubare la provetta per microcentrifuga a 37 ° C per 90 min.
- Sostituire collagenasi Una soluzione con 500 microlitri 1X Triplo Express in modoluzione e incubare a 37 ° C per 15-20 min.
- Rimuovere la soluzione Triplo Express e lavare i DRG con 1 ml di terreno di coltura preparato (contenente il 5% FBS) per 3 volte.
- Aggiungere 600 microlitri di media cultura e pipettare delicatamente su e giù per triturare i tessuti per 20-30 volte utilizzando un ml 1 blu, pipetta graduata punta.
- Dopo triturazione, permettere ai non-tessuti dissociati per regolare verso il fondo del microcentrifuga e trasferire la sospensione cellulare in un tubo 10 ml sterile. Aggiungere un altro mezzo di 600 microlitri cultura e ripetere l'operazione fino a quando triturazione maggior parte dei tessuti sono dissociati. La sospensione cellulare ottenuta contiene sia neuroni e cellule non neuronali. Nella maggior parte dei casi, le cellule da 6 DRG (~ 5 x10 4) vengono utilizzati per una reazione elettroporazione.
4. La manipolazione genetica dei neuroni attraverso elettroporazione
- Preparare la soluzione di trasfezione mescolando la soluzione nucleofection Amaxa per i neuroni di topo con i plasmidi di DNA (~ 10 mcg) O oligo siRNA (~ 0,2 nmol) per ottenere un volume finale di 100 microlitri per ogni trasfezione.
- Centrifugare le cellule dissociate a 680 rpm per 7 minuti a temperatura ambiente, e il surnatante quanto possibile. Aggiungere la soluzione preparata trasfezione e pipettare delicatamente su e giù per 3-4 volte con 200 puntali pl per risospendere le cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare miscelato con la soluzione trasfezione alla cuvetta elettroporazione e elettroporare le cellule utilizzando il sistema Amaxa Nucleofector programma G-013.
- Dopo elettroporazione, immediatamente aggiungere 500 pl di pre-riscaldato (37 ° C) mezzo di coltura contenente FBS al cuvetta e trasferire tutta la soluzione (~ 600 pl) nella piastra di coltura rivestita a densità cellulari desiderati. Per esperimento che richiede risospensione e ri-placcatura, i neuroni sono coltivate direttamente sul piatto di coltura in plastica ad alta densità (10000-20000 cellule / pozzetto). Per l'esperimento che esamina direttamente la crescita degli assoni, i neuroni sono placcati ONTO coprioggetto di vetro rivestite a bassa densità (3000-5000 cellule / pozzetto). Posizionare la piastra di coltura in incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Quattro ore dopo la placcatura quando i neuroni si sono attaccati ai substrati, gentilmente sostituire il terreno di coltura (che contiene la soluzione nucleofection Amaxa) con 500 microlitri mezzo di coltura fresco e pre-riscaldata, e restituire la piastra per l'incubatore per la cultura supplementare (37 ° C , 5% CO 2). Entrambi mezzo di coltura contenente FBS o il terreno privo di siero può essere utilizzato in questa fase.
5. Coltura di neuroni adulti DRG per l'analisi Axon crescita
- Per neuroni trasfettate con plasmidi di DNA, l'espressione del gene d'interesse (ad es EGFP) può essere osservato già dopo alcune ore uno elettroporazione. Per i neuroni trasfettate con siRNA, siamo soliti attendere 3-4 giorni per consentire l'esaurimento sufficiente delle proteine endogene. Le colture di neuroni possono essere direttamente fissato per l'analisi la crescita degli assoni a varionoi il tempo punti (1-4 giorni dopo l'elettroporazione) o ri-sospensione e ri-placcato per analizzare la ricrescita degli assoni (vedi sotto).
- Per RNAi-mediate perdita di funzione studi, i neuroni in coltura possono essere risospeso e ri-piastrate per consentire assoni di ricrescere da neuroni, in cui le proteine bersaglio sono già esauriti. Per fare ciò, sostituire il vecchio mezzo cultura dei neuroni in coltura ad alta densità con 1 ml preriscaldata mezzo fresco e pipetta delicatamente su e giù per 6-10 volte a ri-sospendere i neuroni collegati dalla piastra di coltura. Poiché cellule non neuronali (ad esempio le cellule di Schwann) attribuiscono molto più stretto al piatto cultura che i neuroni, le re-cellule sospese sono per lo più neuroni.
- Trasferire i risospesi neuroni in una provetta da microcentrifuga e delicatamente triturare 10-15 volte a ri-separare i grumi di cellule nella sospensione singola cella.
- Re-piastra di re-neuroni dissociati sul coprioggetto appena preparati a bassa densità (3000-5000 cellule / pozzetto) e la cultura per tutta la notte (16-24 ore).
6. Fissazione, Immuno-colorazione, e fluorescenza Imaging
- Aspirare il mezzo e aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) (200 pl / pozzetto) per fissare le cellule per 15-20 min a temperatura ambiente. Le cellule fisse vengono poi lavate con 1X PBS per 3 volte.
- Aspirare il PBS e aggiungere la soluzione bloccante (1% albumina di siero bovino, 0,1% Triton X-100, 2,0% e siero di capra normale in 1X PBS) per i neuroni fissi per 60 min a temperatura ambiente.
- Per assoni etichette, i neuroni sono immuno-colorato con anti-neurofilamenti o anticorpi anti-βIII tubulina. Per fare ciò, una goccia 30μl di soluzione di anticorpo primario (1:1200 diluizione per anticorpo βIII-tubulina) su una parafilm per ogni coprioggetto. Invertire i coprioggetti e metterli sulla soluzione di anticorpo primario per 60 min a temperatura ambiente.
- Torna coprioggetti alla piastra cultura originale e lavarli con 1X PBS per 3 volte.
- Ripetere la stessa procedura per l'uno secondariotibody.
- Lavare i coprioggetti con acqua distillata per 3 volte, e poi montare coprioggetto su vetrini con la soluzione di montaggio (ad esempio prolungare Antifade Gold).
- I neuroni colorati possono essere esposte con qualsiasi sistema di microscopia a fluorescenza equipaggiato con una fotocamera digitale. Le lunghezze di assoni sono stati misurati e analizzati con il software di analisi di imaging.
7. Risultati rappresentativi
In assenza di fattori di crescita aggiunto extracellulari, i neuroni DRG adulti solito inizia a crescere assoni 48 ore dopo la prima placcatura. Gli assoni spesso mostrano morfologie ramificati (Figura 1). Al contrario, i re-placcati neuroni iniziano a estendere assoni solo poche ore dopo la placcatura, e gli assoni allungato con molto ridotto ramificazione (Figura 2). Questi risultati indicano che la re-placcati neuroni condividono proprietà simili a quelle dei neuroni condizionamento lesionati. Utilizzando questo approccio, abbiamo recentemente eseguito in perditadi funzione studi per esaminare il ruolo della trascrizione fattore di rigenerazione assonale associato c-Jun in crescita assonale, adulti neuroni DRG in vitro. I risultati hanno mostrato che elettroporazione di un gruppo di 4 siRNAs diversi destinati differenti regioni di c-Jun (ON-TARGETplus) marcatamente ridotto i livelli di proteina di c-Jun in adulti neuroni DRG 3 giorni dopo la trasfezione (figura 3) 9. Quando i neuroni sono stati ri-plated e colta durante la notte, la crescita assonale, c-Jun atterramento neuroni è risultata significativamente ridotta (Control: 348,37 ± 16,21 millimetri; SI-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micron, Figura 3) 9. Questi risultati indicano che le colture di neuroni DRG adulti fornire un sistema utile modello per studiare crescita assonale neuroni adulti.
Figura 1. Adulti neuroni di topo coltivati DRG a bassa densità per 3 giorni. I neuroni sono stati colorati con anti - & beta; anticorpi tubulina III. Si noti che la maggior parte degli assoni mostrano morfologie ramificati. Scale bar: 125 micron.
Figura 2. Re-plating topo adulto DRG neuroni dopo 3 giorni di coltura. (A) neuroni DRG adulti coltivati ad alta densità per 3 giorni. (B) Re-plated neuroni DRG adulti sono stati coltivati a bassa densità per il pernottamento. Si noti che la maggior parte degli assoni mostrano morfologie allungate con poca ramificazione degli assoni. Scale bar: 250 micron in A e 125 micron di B.
Figura 3. Ruolo di c-Jun in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti in vitro. (A) Western blot di c-Jun in topo adulto DRG neuroni dopo l'elettroporazione di c-Jun siRNA. Il risultato mostra il livello notevolmente ridotto di c-giu. (B) neuroni di controllo trasfettate con EGFP sono cresciuti lunghi assoni dopo la ri-plating e cultura durante la notte. (C) Co-transperfezione di c-Jun siRNAs EGFP e la crescita degli assoni compromessa da adulti neuroni DRG dopo la ri-plating e cultura durante la notte. Rosso: Tuj-1 colorazione; Green: EGFP. Scale bar: 125 micron. Questi risultati sono stati pubblicati in Saijilafu et al. 9.
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Discussion
Adulti neuroni DRG rigenerare i loro assoni robusta dopo lesioni dei nervi periferici in vivo e in vitro, fornendo così un sistema utile per studiare la rigenerazione degli assoni negli animali adulti. Coltura in vitro di neuroni DRG adulti sta diventando un metodo ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari attraverso i quali la rigenerazione degli assoni è regolamentata. La procedura in vitro di neuroni adulti, la coltura del mouse DRG qui presentato consente una rapida ed efficace lo studio genetico della crescita assonale rigenerativa. Il risospensione e ri-placcatura procedura è particolarmente utile per la perdita di funzione studi perché consente assoni ricrescere da neuroni in cui la proteina mirata è già stato impoverito. Inoltre, ri-placcatura neuroni in coltura DRG simula un effetto in vivo lesione condizionamento, fornendo così un approccio più fisiologico rilevante per studiare la rigenerazione assonale in vitro.
L'efficienza di transfezione di adulto DRG neurons con l'approccio descritto elettroporazione è circa 20-50% per i plasmidi di DNA a seconda delle dimensioni dei costrutti, che è sufficiente per l'analisi morfologica della crescita assonale. Rispetto a elettroporazione, il virale trasferimento genico mediato da ha un'efficienza molto più alta, che è adatto per l'analisi biochimica usando neuroni DRG. Tuttavia, la costruzione e la produzione di virus per ogni gene d'interesse del lavoro sta consumando molto più intenso e il tempo. Per oligo siRNA, l'efficienza di transfezione può raggiungere quasi il 90% in base all'efficienza abbattimento delle proteine bersaglio (si veda figura 3A), il che rende l'analisi biochimica di adulti neuroni DRG possibili. Tuttavia, l'effetto di siRNAs riduce dopo un periodo più lungo a causa della degradazione degli oligonucleotidi siRNA.
Quando i neuroni sono co-trasfettate con plasmidi 2 mescolati in rapporto 1:1, il plasmide con dimensioni più piccole di solito ha efficienza di trasfezione superiore al plasmide con dimensioni maggiori. Come arISULTATO, regolando il rapporto dei due plasmidi cambierà la co-trasfezione di conseguenza l'efficienza. SiRNA per la transfezione, spesso co-trasfezione i neuroni con EGFP ai neuroni di etichette. Poiché gli oligonucleotidi siRNA sono molto più piccoli EGFP, la loro efficienza di trasfezione è molto più alta. Pertanto, nei nostri esperimenti abbiamo in generale penso che tutti i neuroni EGFP positivi sono anche positivi per siRNA.
Molti studi profili genetici dei neuroni DRG adulti dopo assotomia periferiche hanno identificato un gran numero di geni associati rigenerazione (stracci) 10-12, che si ritiene alla base della capacità di rigenerazione dei neuroni DRG adulti. Tuttavia, le funzioni di questi stracci nella mediazione crescita assonale di neuroni DRG adulti non sono stati ben caratterizzati. Qui abbiamo esaminato il ruolo di un noto RAG, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti tramite RNAi-mediata perdita di funzione di approccio. Tale metodo fornisce un valido strumento in vitro per indaginite i ruoli di stracci altri regolazione della rigenerazione assonale.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di FZ dal NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
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