冰结合蛋白(IBPS),也被称为抗冻蛋白,抑制冰的生长及组织的冷冻保存中使用的是一个有希望的添加剂。调查IBPS使用的主要工具是纳升渗压计。我们开发了一个设计的冷却阶段安装在光学显微镜和控制使用一个自定义内置的LabVIEW常规。这里所描述的纳升渗压计在一个超灵敏的操纵样品的温度。
冰结合蛋白(IBPS),包括抗冻蛋白,冰结构蛋白,热滞蛋白,冰结晶抑制蛋白,被发现在冷适应的有机体,并保护它们与冰晶冷冻损伤。 IBPS被发现在各种有机体,包括鱼1, 植物2,3,节肢动物4,5 6,真菌和细菌7。 IBPS吸附到冰晶体的表面,并防止水分子从加入冰格在IBP吸附位置。制冰上生长的晶体表面之间的吸附IBPS开发高曲率,降低温度,在该温度下的冰晶体的成长,作为为Gibbs-Thomson效应提到的现象。此抑郁创建的熔点和冰的生长,在其内被逮捕8-10,参见图1的非平衡凝固点之间的间隙(热滞后,TH)。上IBP研究中使用的主要工具是e的纳升渗压计,这有利于测量TH活动的IBP解决方案。纳升渗压计,如克利夫顿仪器“(克利夫顿技术物理系,哈特福德,纽约州)和奥塔哥仪器”(奥塔哥渗压计,达尼丁,新西兰),设计用于测量溶液的渗透压测量的熔点抑郁症的液滴纳升卷。这些设备被用来测量生物样品,如眼泪11的渗透压,并在IBP研究发现是有用的。这些纳升渗压计的手动控制限制了实验的可行性。温度变化率的变化,无法可靠地进行控制,克利夫顿仪器的温度范围内被限制到4000毫渗透摩尔(约-7.5℃),并作为时间的函数的温度记录这些仪器不是可用的选项。
我们设计了一个特制的计算机控制的南欧力特渗压计系统使用LabVIEW平台(美国国家仪器公司)。冷阶段,前面描述的9,10,包含一个金属块,水通过该循环,从而起到作为散热器,请参阅图2。附加到该块是可以使用商业的温度控制器,该控制器可以控制通过LabVIEW模块驱动的热电冷却器,请参阅图3。下面提供进一步的细节。该系统的主要优点是它的感温控制, 见图4。自动温度控制,允许一个固定的温度斜坡的协调与视频显微镜输出包含更多的实验细节。
研究TH活动与时间的关系,我们测试了58 kDa的多动IBP从南极的细菌Marinomonas primoryensis(MP IBP)12。这种蛋白质有利于增强型绿色荧光标记蛋白(EGFP)在一个结构开发的彼得·戴维斯组(皇后大学)10。我们发现,受影响的温度变化曲线TH活动。在这些实验中的温度分布的极好的控制显着改善了对TH测量。纳升渗压计,还使我们能够测试IBPS 5星,13的重结晶抑制。在一般情况下,重结晶是一种现象,其中大的晶体生长在牺牲小晶体大。 IBPS有效地抑制再结晶,即使在低浓度14,15。我们使用LabVIEW控制的渗压计,定量跟踪冰的再结晶和执行恒定的冰部分使用的同步实时视频分析的图像和温度反馈,从样品室13。实时计算提供了更多的控制选项,在实验过程中。倒置显微镜发展到一个阶段ccommodate温度控制的微流体装置,这将在其他地方描述16。
冷战阶段系统
冷阶段的组件( 图2)包括一组热电冷却器,冷却铜板。热量被从阶段通过流动冷水通过一个封闭的室下的热电冷却器除去。 4毫米直径的孔,在中间的铜板作为观看窗口。直径1毫米的平面内孔,钻孔,以适应热敏电阻。甲量身定制的铜与几个孔(直径500微米)的光盘(7毫米的直径)的铜板上,并置于与观看窗口对齐。泵入空气的流速为35毫升/秒,并干燥,用燥石膏(华盛顿州哈蒙德)。使用的干燥空气,以确保干燥的环境中,在冷却阶段。该阶段是通过一个9针连接插座连接温度控制器(型号3040或3150,Newport公司尔湾,加利福尼亚州,美国)。温度控制器通过电缆连接到计算机的GPIB-PCI卡(美国国家仪器,奥斯汀,德克萨斯州,美国)。
这项工作表明操作的计算机控制的纳升渗压计的TH活性具有非凡温度控制,使精确的测量。在任何温度敏感的系统中,必须避免不必要的温度梯度。为了避免在这里提出的装置中的温度梯度,在测试溶液液滴必须被定位在铜圆盘冷却阶段(步骤2.7)中的孔的中心。此外,单晶应该是在液滴的中心,而不是靠近边缘(在大多数情况下,这会发生自发)。描述的时间依赖关系表示的冷却速率可能会影响对TH读数。因此,我们建议包括一个报告的时间,在此期间,晶体被暴露到该溶液中,在冷却之前,以及冷却速度。通常,我们等了10分钟前,斜坡下降的温度为0.01°C步骤,每4秒。
LabVIEW的控制合作适于使用倒置显微镜,微流体装置可热操纵oling阶段。此系统有利于涉及冰晶和eGFP的9,10,16具有标记IBPS溶液交 换实验的性能。 LabVIEW的控制系统可适于到克利夫顿阶段通过连接3040通过一个指定的自适应电路的温度控制器。这样一个系统的操作在戴维斯的实验室17。 LabVIEW软件和指定的克利夫顿阶段的适应电路设计可应要求提供。
总之,我们描述了纳升渗压计,有利于敏感的控制和操作的温度和温度的升高和降低的速度(0.002°C灵敏度),配合视频接口,通过LabVIEW的程序进行实时分析。该系统可以进行重复的速率控制实验,是的importan调查IBP与冰相互作用的动力学吨。这样的实验可以解决一些长期争论的问题IBPS行动的机制。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由ISF,NSF,和ERC。我们要感谢技术帮助,兰迪·米尔福德,迈克尔·科伦,道格·谢弗和杰里米·丹尼森的温度阶段。或陈,徐迪,拉杰什Sannareddy,和SUMIT Bhattachary与软件开发提供了援助。我们要感谢我们的合作者教授彼得·戴维斯博士和劳瑞A.格雷厄姆的熔点的 IBP蛋白质和有益的讨论。我们也感谢实验室成员玛雅酒吧DOLEV,扬中市秦,Yeliz切利克博士,博士纳塔利娅Pertaya,Ortal Mizrahy,并为他们的用户反馈Shlomit盖伊博士。
Name | Company | Catalog Number/model | Comments |
Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
Micro 90 cleaning solution | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |