Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.
Içe doğrultucu potasyum (Kir) kanal aile Özgül üyeleri hipertansiyon, atriyal fibrilasyon, ve ağrı 1,2 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları için ilaç hedefleri öne vardır. Çoğunlukla, ancak, onların terapötik potansiyeli hatta temel fizyolojik fonksiyonlarını anlamak doğru ilerleme iyi farmakolojik araçların eksikliği yavaşlatıldı. Nitekim, dahilde doğrultucu ailesinin moleküler farmakoloji kadar nanomolar-afinite ve yüksek selektif peptid toksin modülatörleri sayısı 3 keşfedilmiş olan voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalları, S4 süperailesinin gerisinde kalmıştır. Arı zehiri tertiapin toksin ve bunun türevleri 4,5 Kir1.1 ve Kir3 kanallarının potent inhibitörleri olan, fakat peptidler deneysel tedavi edici olarak hem de sınırlı kullanımlı bunların antijenik özelliklere ve zayıf biyo-, metabolik stabilite ve doku penetrans bağlıdır. Güçlü bir geliştirmeve gelişmiş farmakolojik özellikleri ile seçici küçük moleküllü probları tam fizyoloji ve Kir kanallar terapötik potansiyelini anlamak için bir anahtar olacaktır.
Akademik bilim adamları daha iyi farmakoloji 6 ihtiyacı moleküler hedefler ve sinyal yolları için prob keşif kampanyalar başlatmak için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Moleküler Kütüphaneler Sondalar Üretim Merkezi Ağ (MLPCN) (NIH) Ortak Fon fırsatlar yaratmıştır. MLPCN araştırmacılar sanayi ölçekli tarama merkezleri ve tıbbi kimya ve bilişim genler ve gen ağlarının işlevi aydınlatmak için küçük-molekül probları geliştirmeniz için size destek erişim sağlar. MLPCN giriş kazanıyor kritik adım yüksek çıktılı tarama (HTS) için müsait bir sağlam hedef veya yol özgü testinin gelişmedir.
Burada, bir floresans tabanlı talyum (Tl +) akı assa nasıl geliştirileceğini açıklaryüksek verimli tarama bileşik 7,8,9,10 Kir için kanal işlevi y. tahlil geçirgenlik K + K + türdeş Tl + için kanal gözenek dayanmaktadır. Ticari olarak kullanılan floresan Tl + raportör boya gözenek içinden Tl transmembran akı + tespit etmek için kullanılır. BTC, FluoZin-2, 7,8 ve FluxOR: Tl + akı deneyleri için uygun olan, en az üç ticari olarak temin boyalar bulunmaktadır. Bu protokol, FluoZin-2 kullanılarak analiz gelişimi açıklanmaktadır. Aslında gelişmiş ve çinko göstergesi olarak pazarlanan rağmen, FluoZin-2 sergiler Tl üzerine floresans emisyon + bağlayıcı bir sağlam ve doza bağımlı artış. Biz FluxOR 7,8 sunulmuştu ve böylece 9,10 yapmaya devam etmişlerdir önce FluoZin-2 ile çalışmaya başladı. Ancak, test geliştirme adımları her üç boyalar için temelde aynıdır, ve kullanıcılar kendi özel n için en uygun olan boya belirlemelidireeds. Biz de MLPCN giriş için dikkate alınması gereken ulaşmış olmalıdır test performans kriterleri tartışacağız. Tl + kolayca en K + kanalları nüfuz bu yana, tahlil en K + kanal hedeflerine uyarlanabilir olmalıdır.
Veri işlem: Bir kez veri analizi, ortak bir denemede, F 0 başında başlangıç değerinin her bir kuyunun floresan tepki, F, normalize içerir toplanır. Bu genellikle "statik oran" olarak adlandırılır ve "F / F 0" sembolize edilir. F 0 İndikatör boya hakim olduğu durumlarda statik oranı operasyonu büyük ölçüde, aydınlatma, sinyal toplama disuniformities gibi birçok faktörler düzeltecektir ve hücre sayı…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Sağlık hibe 1R21NS073097-01 ve 1R01DK082884 (JSD) ve National Institutes hibe PIER11VCTR Vakfı National Institutes of fon tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.