Summary
Мы представляем метод сбора спинномозговой жидкости (ликвора), а также создать систему, которая испытывает недостаток CSF в эмбриональном системе желудочков мозга рыбок данио. Это позволяет для дальнейшего рассмотрения CSF состав и требования во время эмбрионального развития головного мозга.
Abstract
Спинномозговой жидкости (ликвора) представляет собой белок, богат жидкости, содержащейся в желудочки мозга. Он присутствует во время раннего эмбрионального развития позвоночных и сохраняется на протяжении всей жизни. Взрослые CSF, как полагают, чтобы смягчить мозга, удаление отходов, а также осуществлять выделяются молекулы 1,2. В эмбрион взрослого и старше, большинство из CSF производится сосудистое сплетение, ряд весьма васкуляризированной секреторных регионов, расположенных рядом с желудочки головного мозга 3-5. У рыбок данио, сосудистое сплетение полностью сформирован на 144 часов после оплодотворения (HPF) 6. До этого, в обоих рыбок данио и других эмбрионов позвоночных, включая мышь, значительное количество эмбриональных CSF (eCSF) присутствует. Эти данные и исследования на куриных предположить, что нейроэпителия является секреторным на ранней стадии развития и может быть основным источником eCSF до сосудистое сплетение развития 7.
eCSF содержит примерно в три раза больше белка тХан взрослых CSF, предполагая, что она может играть важную роль в процессе развития 8,9. Исследования, проведенные в кур и мышей показали, что выделяемые факторы в eCSF, давление жидкости, или комбинация из них, которые важны для нейрогенеза, экспрессия генов, пролиферацию клеток, и выживание клеток в нейроэпителии 10-20. Proteomic анализы человека, крысы, мыши и куриных eCSF выявили много белков, которые могут быть необходимы для функции CSF. Они включают в себя компоненты внеклеточного матрикса, аполипопротеинов, регулирующие осмотическое давление белков и белков, участвующих в клеточной гибели и пролиферации 21-24. Тем не менее, сложные функции eCSF в значительной степени неизвестны.
Мы разработали метод для удаления eCSF из желудочков мозга у рыбок данио, что позволяет для идентификации компонентов eCSF и для анализа требований eCSF в процессе разработки. Хотя более eCSF могут быть собраны из других позвоночных систем Wго больше эмбрионов, eCSF может быть собрана с самых ранних стадиях развития данио рерио, а под генетическими или экологическими условиями, которые приводят к ненормальной объема желудочков мозга или морфологии. Удаление и сбор eCSF позволяет масс-спектрометрический анализ, исследование функции eCSF, и реинтродукции выберите факторов в желудочки для анализа их функции. Таким образом, доступность ранних эмбрионов данио рерио позволяет детальный анализ функций eCSF в процессе разработки.
Protocol
1. Подготовка Микроинъекция Иглы и сотовый трамвай
- Заполните Eppendorf CellTram нефти микроинъектор аппарат с минеральным маслом в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Подготовка микроинъекции иглы, потянув капиллярных труб с помощью инструментов Sutter иглы съемника.
- Установить иглу на микроманипулятора подключен к Eppendorf CellTram.
- Аккуратно разбить кончик иглы. Для равномерного размер чаевых, измеряют с помощью микрометра, или сравнить с эталонным иглы.
- Заполните длина иглы с маслом, используя CellTram нажать нефти по всей длине, будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.
2. Подготовка эмбрионов
- Ткните отверстия в 1% агарозном блюдо с покрытием 1-200 мкл кончика пипетки, и удалить агарозном пробки. Заполните блюдо с эмбрионом средствах массовой информации (в соответствии с Westerfield 25).
- Используя щипцы, dechorionate эмбрионов под стереомикроскопа.
- Передача dechorionated эмбрионовв агарозном покрытием блюдо.
- Чтобы обезболить эмбрионов, добавить Tricaine (0,1 мг / мл), чтобы блюдо агарозы, пока эмбрионы перестали двигаться (производится в соответствии с Westerfield 25).
3. Слив eCSF
- Orient эмбрионов с хвостами в отверстия агарозы и их задней стороны ближе к микроманипулятора, что позволяет визуализировать спинной стороне головного мозга.
- Расположите иглу в ромбомеров 0/1 петля-точка или точка широкого заднего мозга желудочка (рис. 1А).
- Осторожно пробить крышу пластины заднего мозга желудочка будучи уверенным, что не пройти глубине мозга в желтке.
- Слейте eCSF помощью CellTram и собирают жидкость в микроинъекции иглы. Будьте осторожны, чтобы избежать любых клеток.
4. Сбор eCSF для анализа состава
- После того, eCSF собирается в иглу, осторожно остановить всасывания из CellTram.
- Moве блюдо из-под иглы и тщательно позиционировать иглу в пробирку, содержащую желаемый буфера.
- Использование CellTram, процедить eCSF из иглы в буфер пытается избежать загрязнения раствора с маслом.
- Для того, чтобы удалить клетки, которые вы атмосферный вместе с eCSF, спина eCSF при 10000 х г. Соберите чистых eCSF (супернатанта) и хранить при температуре -80 ° С до готовности для дальнейшего анализа.
5. Реинтродукции отдельных факторов
- Слейте eCSF каждые 2 часа в течение желаемого интервала времени, так как жидкость пополняется в течение этого периода времени. Между дренажных моменты времени, извлеките иглу и хранения эмбрионов при 28,5 ° C или желаемую температуру.
- Загрузите вторую иглу микропипетки с испытательным фактор.
- Место иглы в микроманипулятора прикреплены к микроинъектор.
- Отрегулируйте объемом впрыска до 1 NL путем измерения размера капель в масло и регулирования времени впрыска и рressure.
- Вводят 1-2 п в желудочки головного мозга, как описано выше 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример осушенных желудочков мозга показано на рисунке 1B-C. Желудочков мозга свернуты, поскольку они лишены eCSF (рис. 1б и C). Как видно из спинного изображения (рис. 1B-C, и рис. 2A-D) заднего мозга нейроэпителия делает сохранить свою характерной морфологией и, кажется, быть открытым, несмотря на отсутствие eCSF вероятно, связано с надежной шарнирно пунктов. Однако, боковой вид (рис. 2A'-D ') показывают, что задний мозг желудочке слита, в соответствии с наличием тонкой гибкой пластины эпителия крыши, которая разрушается вентрально. В диком эмбрионов типа, eCSF постоянно производятся и наполняет желудочки головного мозга 2-3 ч после слива (рис. 2). Таким образом, CSF должно быть постоянно обедненным с течением времени интерес.
В то время как удаление жидкости при 24 HPF не нарушает валового морфологии и развития, удаление eCSF в течение более длительного в йод развития может иметь негативные последствия для всего развития организма. Это должно быть принято во внимание при определении эффективности факторов вводят в желудочки мозга. Кроме того, для определения дефектов развития являются результатом потери eCSF или из-за проколов иглой мозга, важной контроль вставки иглы в мозг, не удаляя eCSF.
Мы показали, что eCSF имеет свой профиль белка, чем весь экстрактом эмбриона, и анализ на SDS-PAGE гель белков показывает, что обнаруживаемые количества белка могут быть собраны из рыбок данио eCSF (рис. 3). Это показывает, что нейроэпителиальных сотовой загрязняющие вещества на более низком уровне, чем eCSF специфических белков, а также, что существенное количество белка может быть собрано, что является достаточным для масс-спектрометрического анализа.
3/4243fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Вручную слить желудочки мозга. (A) Экспериментальный дизайн. Боковой (слева) и спинного (справа), вид куда вставлять микроинъекции иглы. Needle (черный треугольник) вставляется в потолочной панели заднего мозга желудочка в самом широком месте заднего мозга. Затем иглу вставляют в дальнейшем среднего и переднего мозга желудочки, обозначенных красными стрелками. (BC) Примеры из 24 HPF вручную слить эмбриона. То же эмбрион отображаемого перед сливом (B) или после слива (C). (B 'C') начертаний до нашей эры. Серая линия показывает морфологии присутствует, но не видно. F = передний мозг, M = средний мозг, H = мозге. Шкала баров = 50 мкм.
Рисунок 2. ECSF заправки желудочков мозга с течением времени. (A) 24 HPF эмбриона перед сливом (B) сразу после Т = 0 (C) 15, (D) 60 (E) 120, (F) 180, (G) 240, а (H) 300 мин (м) после слива. (AH) Спинной и (А '-H') боковое изображение светлое с передним влево. F = передний мозг, M = средний мозг, H = мозге. Шкала баров = 50 мкм.
Рисунок 3. Белки профиль отличается от 24 HPF целого эмбриона данио рерио (WE) экстракт (0,5 мкг общего белка) и 24 HPF eCSF от 50 эмбрионов. SDS загрузки буфера добавляют к собраны eCSF для денатурации белков, образец работать на 8% Трис-HCl геле, и обнаружил с SYPRO Ruby. * Указывают на полосах уникальны для eCSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование этой техники вручную слить eCSF из желудочков мозга у рыбок данио будут полезны для определения потребности в eCSF в процессе разработки. Кроме того, эта методика позволит описание профиля белков eCSF в течение эмбрионального развития. Определение различных белков, в течение этого времени будет способствовать дальнейшему расследованию функция ликвора и его потенциальная роль в развитии мозга. В амниот, некоторые факторы, указанные в eCSF (IGF2, FGF2, ретиноевая кислота и аполипопротеинов) имеют продемонстрировал роль в нейроэпителиальных выживаемость клеток, пролиферации и нейрогенез 13,17,20,23,27,28. Однако, по всей видимости, сотни охарактеризованных белков в eCSF, который был получен после формирования сосудистого сплетения, позднее моменты времени показано здесь. Кроме того, наша лаборатория и другие определили рыбок данио мутантов с ненормального размера желудочков мозга или мозга дефекты 29-31, и может ВГАэлектронной нарушения в eCSF состав и функции. Этот метод позволяет легко выделения и тестирования предполагаемых ненормальные eCSF от мутантов или в различных экологических условиях.
Мощный использование рыбок данио системы заключается в замене отдельных факторов с помощью инъекции в желудочки головного мозга после удаления eCSF, тем самым проверяя их функции во время развития мозга. Малые молекулы, белки и eCSF, полученные после генетической или химического возмущений может быть проверена. Реинтродукция eCSF от других видов позволят сравнение факторов и функций у разных видов и в разных патологических состояний, таких как гидроцефалия, дополняя и взаимодействия с млекопитающих исследований. Таким образом, использование рыбок данио, чтобы удалить eCSF, анализ ее состава и вновь eCSF или специфических факторов в желудочки головного мозга, позволит значительно увеличить понимание роли и регуляции функции eCSF и желудочковой системы головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института психического здоровья и Национального научного фонда. Особая благодарность доктору Джен Gutzman, доктор Аманда Дикинсон и другие члены Sive лаборатории за многочисленные полезные обсуждения и конструктивной критики, и Оливье Paugois для экспертов хозяйства рыбы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
