Summary
/ कंस्ट्रिकटर फैलनेवाली (दबाव myography) प्रतिक्रियाओं के माप के साथ समानांतर में अलग धमनी myocytes (पैच electrophysiological तकनीकों दबाना का उपयोग) में Kv7 (KCNQ) पोटेशियम चैनल गतिविधि की माप संवहनी चिकनी मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान में Kv7 चैनलों की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं और औषध.
Abstract
या प्रतिरोध धमनियों की दीवारों के भीतर चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का संकुचन और विश्राम धमनी व्यास निर्धारित करता है और जिससे पोत के माध्यम से रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करता है और प्रणालीगत रक्तचाप के लिए योगदान देता है. संकुचन प्रक्रिया साइटोसोलिक कैल्शियम ([2 Ca +] CYT) एकाग्रता, जो आयन ट्रांसपोर्टरों और चैनलों की एक किस्म के द्वारा नियंत्रित बारी में मुख्य रूप से नियंत्रित किया जाता है. आयन चैनलों संकेत पारगमन रास्ते में आम मध्यवर्ती vasoactive हार्मोन द्वारा सक्रिय वाहिकासंकीर्णन या vasodilation प्रभाव हैं. और आयन चैनल अक्सर चिकित्सकीय या तो जानबूझकर एजेंट या अनजाने (अवांछित हृदय दुष्प्रभाव पैदा करने के लिए जैसे) (जैसे कैल्शियम चैनल ब्लॉकर्स vasodilation और निम्न रक्तचाप के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है) द्वारा लक्षित कर रहे हैं.
Kv7 (KCNQ) वोल्टेज सक्रिय पोटेशियम चैनलों हाल ही में महत्वपूर्ण शारीरिक और चिकित्सकीय targ के रूप में फंसाया गया हैचिकनी मांसपेशी संकुचन के विनियमन के लिए टिकट. दोनों शारीरिक संकेत पारगमन में और चिकित्सीय एजेंटों की कार्रवाई में Kv7 चैनलों की विशिष्ट भूमिका स्पष्ट करने के लिए, हम अध्ययन कैसे उनकी गतिविधि सेलुलर स्तर पर संग्राहक के रूप में अच्छी तरह के रूप में बरकरार धमनी के संदर्भ में उनके योगदान का मूल्यांकन करने की जरूरत है.
चूहे mesenteric धमनियों एक उपयोगी मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं. धमनियों आसानी से हो सकता है, dissected संयोजी ऊतक के साफ, और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पृथक धमनी myocytes को तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, या cannulated और vasoconstrictor / vasodilator प्रतिक्रियाओं की परिस्थितियों में अपेक्षाकृत शारीरिक माप के लिए दबाव डाला. यहाँ हम माप के दोनों प्रकार के लिए इस्तेमाल किया विधियों का वर्णन और कैसे प्रयोगात्मक डिजाइन संवहनी टोन के नियमन में इन आयन चैनल की भूमिका की एक स्पष्ट समझ प्रदान करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है के कुछ उदाहरण प्रदान करते हैं.
Protocol
1. छोटे आंत्र mesenteric संवहनी आर्केड के सर्जिकल छांटना
- एक 300-400 isoflurane साथ छ चूहे Sprague-Dawley (4%) साँस लेना द्वारा प्रशासित anesthetize.
- एक midline छोटी आंतों अन्त्रपेशी बेनकाब laparotomy प्रदर्शन. महान देखभाल के साथ पेट चीरा के माध्यम से छोटी और बड़ी आंत अमल में लाना उजागर आंत्र और अन्त्रपेशी आघात से बचने के लिए. धीरे बाँझ धुंध पर अन्त्रपेशी बाहर प्रशंसक.
- शल्य चिकित्सा आबकारी छोटी आंत और बड़ी आंत के एक हिस्से काएकुम (रक्त वाहिकाओं ध्यान मार्जिन के साथ और बेहतर mesenteric धमनी नस / प्राथमिक शाखाओं से मूल में कटौती) सहित,.
- एक बर्फ के ठंडे विदारक समाधान (1 टेबल) युक्त बीकर excised ऊतक स्थानांतरण.
- आंत का काटना के बाद, चूहा humanely जबकि संज्ञाहरण के तहत euthanized चाहिए.
2. एक विच्छेदनधमनियों की सफाई
- स्थानांतरण excised आंत और mesenteric आर्केड एक ठंडा विदारक कक्ष (4-5 डिग्री सेल्सियस) विदारक समाधान युक्त. चैम्बर एक SYLGARD 184 elastomer आधार के साथ एक 100 मिमी ग्लास पेट्री डिश विदारक पिन को समायोजित करने के होते हैं, पेट्री डिश ° 4-5 सी में एक परिसंचारी पानी स्नान के द्वारा बनाए रखा है एक ठंडा आधार में रखा गया है.
- शल्य कैंची का उपयोग पूरे आंत के बाहर एक लगभग 10-12 सेमी खंड में कटौती. आंतों अपने vasculature संलग्न रखने खंड के प्रत्येक के अंत में काटें, और तो अलगाव में संलग्न vasculature (मेसेंतेरिक आर्केड) के साथ एक खंड छोड़ने कक्ष से अप्रयुक्त आंत को हटा दें.
- नीचे छोटी आंत के खंड पिन, ऐसी है कि बेहतर mesenteric धमनी नस / प्राथमिक शाखा केंद्र (1 चित्रा) से केंद्र और शाखाओं विकीर्ण के बाद आदेश में चैम्बर के निकट पक्ष पर अन्त्रपेशी के प्रसार. Pl इक्का आंतों खंड (रक्त वाहिकाओं पर नहीं) पर ही पिन.
- उनके अपेक्षाकृत उज्ज्वल लाल रंग, मोटी दीवारों और यू के आकार नसों में देखा शाखाओं बजाय विशेषता वी के आकार शाखाओं, नसों से धमनियों भेद.
- Visualizing एक प्रबुद्ध विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से, ध्यान से वसा ऊतकों और संयोजी ऊतक 2 एन डी के आसपास साफ - 4 वें क्रम (एक वृत्त चित्र में धराशायी) आंतों सूक्ष्म संदंश और कैंची का उपयोग करने के लिए करीब धमनियों. आसन्न नसों होल्डिंग वसा ऊतकों और संयोजी ऊतक समाशोधन की सुविधा है. धमनियों की अनावश्यक खींच से बचें.
- तो mesenteric धमनी संयोजी ऊतक की मंजूरी दे दी क्षेत्रों बाहर dissected किया जा सकता है और सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया (एकल कोशिका पैच दबाना अध्ययन के लिए, 3-4 धारा) या दबाव myography (5 धारा) के लिए cannulated. शाखा अंक के बीच क्षेत्रों में कटौती, आमतौर पर लंबाई में 1 सेमी.
- अलगाव को समाधान के 0.5 एल (1 टेबल) तैयार है और 2 भागों में पीएच समायोजन करने से पहले इसे विभाजित. पहले भाग (आमतौर पर 100 मिलीलीटर) 37 गरम चाहिए ° C और पीएच 7.2 37 में समायोजित किया जाना चाहिए ° C (37 ° C अलगाव समाधान). अलगाव के समाधान के दूसरे भाग 4 से नीचे ठंडा चाहिए डिग्री सेल्सियस और पीएच 7.2 4 ° C (बर्फ के ठंडे अलगाव समाधान) के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. पीएच समायोजन करने के बाद, दोनों के समाधान की osmolarity D-ग्लूकोज या एच 2 ओ का एक उचित मात्रा जोड़कर mOsm 298 समायोजित किया जा चाहिए
- 37 के 2 मिलीलीटर ° C अलगाव समाधान एक कांच की शीशी और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.4 चरण में प्रयोग के लिए सेते स्थानांतरण गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 37 के 10 मिलीग्राम 20 मिलीग्राम ° C अलगाव समाधान, भंग, 37 को फिर से गर्म ° C और 7.2 पीएच रद्दोबदल. इस समाधान के 2 मिलीलीटर 4 मिलीग्राम कोलैजिनेज प्रकार आठवीं (सिग्मा, 089K8612 लॉट जोड़ने: 633 यूएनआईटी मिलीग्राम / Collagenase गतिविधि, 285 इकाइयों मिलीग्राम / Caseinase गतिविधि, 1.6 इकाइयों मिलीग्राम / Clostripain गतिविधि), 0.64 मिलीग्राम इलास्टेज प्रकार चतुर्थ (सिग्मा, 110M7025V बहुत 5.9 इकाइयों मिलीग्राम / एक 16 मिलीग्राम / एमएल 37 में तैयार स्टॉक के 40 μl जोड़ने ° सी अलगाव) समाधान और 1 की 2 μl डीएल dithiothreitol (डीटीटी सिग्मा) एम, पूर्व गर्म 37 के लिए इस एंजाइम समाधान ° C 3.5 कदम के लिए तैयार करने में.
- Mesenteric धमनी की एक ऊतक 35 मिमी संस्कृति डिश में बर्फ के ठंडे अलगाव समाधान और पकवान जगह पर बर्फ के 2 मिलीलीटर युक्त 2-3 खंडों स्थानांतरण. Mesenteric धमनी क्षेत्रों 3-4 मिमी लंबे टुकड़ों में काटें.
- आग पॉलिश टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग (धमनियों की हानिकारक रोकने के लिए) एक गिलास (15 x 45 मिमी, 1 घूंट) 2 पूर्व गर्म मिलीलीटर युक्त 37 शीशी में धमनी खंडों हस्तांतरण ° C अलगाव और 37 पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते डिग्री सेल्सियस
- 30 मिनट के बाद, ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस अलगाव एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर समाधान निकालना, 35 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर गर्म एनजाइम समाधान और सेते जोड़ें37 डिग्री सेल्सियस
- एंजाइम समाधान में 35 मिनट ऊष्मायन के तुरंत बाद, बर्फ पर शीशी जगह, एंजाइम समाधान aspirate और बर्फ के ठंडे अलगाव समाधान (दोहराने आकांक्षा और ताजा बर्फ के ठंडे अलगाव समाधान के अलावा 4 बार) के 2 मिलीलीटर जोड़ें. फिर, बर्फ के ठंडे अलगाव समाधान के 1 मिलीग्राम की मात्रा में, धीरे पॉलिश पाश्चर विंदुक 10-20 व्यक्ति mesenteric धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (MASMCs) जारी करने के समय के साथ धमनी खंडों महीन चुर्ण बनाना.
- समय - समय पर एक 35 मिमी पकवान पर सेल निलंबन की एक बूंद रखने और एक खुर्दबीन के नीचे देखने myocytes उपस्थिति की पुष्टि. स्वस्थ MASMCs एक चिकनी लम्बी उपस्थिति होनी चाहिए. धमनियों की दीवार में कोशिकाओं के सभी जारी नहीं किया जाएगा. सेल निलंबन बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
- MASMC स्वास्थ्य का एक अन्य उपयोगी सूचक शारीरिक Ca 2 + सांद्रता के अपने सहिष्णुता है. स्नान के साथ रिकार्डिंग कक्ष (बायोसाईंस उपकरण, # सीएससी 25L) भरें2 मिमी 2 CACL (कमरे के तापमान (आर टी) पर 7.3 पीएच, रचना के लिए देखें तालिका 1) और स्थिति अगर पुल (तुला ग्लास 2 एम KCl में 2% अगर साथ भरा केशिका, संदर्भ इलेक्ट्रोड में डाला (वार्नर साधन, रेफरी युक्त olution ) सदन के अंदर) 3L. पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक रिकॉर्डिंग चैम्बर के लिए लगभग 100-200 μl सेल निलंबन हस्तांतरण और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं. Undamaged कोशिकाओं काफी 2 मिमी में अनुबंध नहीं चाहिए CACL समाधान 2 युक्त (कोशिकाओं को लम्बी या छड़ के आकार का होना दिखाई देते हैं, गेंदों में गोल नहीं चाहिए).
- रिकॉर्डिंग चैम्बर के लिए सेल निलंबन के पहले अशेष भाजक जोड़ने, स्नान समाधान के 0.25 मिलीलीटर युक्त 2 मिमी के बाद 2 CACL सेल निलंबन की शेष मात्रा को जोड़ा जाना चाहिए. यह शेष सेल निलंबन बर्फ पर इस समाधान में बनाए रखा जा सकता है और 6 घंटा लिए पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है.
4.पूरे सेल पैच दबाना का प्रयोग करने के लिए उपाय में Kv7 पोटेशियम धाराओं या वोल्ट झिल्ली
- बाद myocytes रिकॉर्डिंग कक्ष (25 मिमी नंबर 1 दौर कवर स्लिप, वार्नर उपकरण) के गिलास आधार का पालन करने के लिए, स्नान समाधान (1 टेबल) के निरंतर छिड़काव आरंभ करें. KV1 और KV2 परिवारों की देरी सही करनेवाला पोटेशियम धाराओं से अलगाव में Kv7 धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए, स्नान समाधान 100 सुक्ष्ममापी GdCl 3 के साथ पूरक होना चाहिए.
- Borosilicate ग्लास (Kimax-51, Kimble चेस) से एक पैच विंदुक विंदुक खींचने और microforge का उपयोग निर्माण, इसके प्रतिरोध 4-5 MΩ हो है जब आंतरिक समाधान (1 टेबल) के साथ भरा जाना चाहिए. कोट 184 SYLGARD के साथ विंदुक (~ टिप ऊपर 1-2 मिमी) कम / 3 1.
- में Kv7 धाराओं के MASMCs रिकॉर्डिंग के लिए, छिद्रित पैच पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप तकनीक का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक छिद्रित पैच विन्यास का उपयोग करने के लिए depletio को रोकने में मदद करता हैn की झिल्ली (2 रंज) 4,5 bisphosphate और बाद में तेजी से Kv7 धाराओं, जो आमतौर पर पारंपरिक उठी पैच विन्यास का उपयोग कर मनाया जाता है (5 मिनट के भीतर) ठहरनेवाला phosphatidylinositol. 120 ग्राम / एमएल amphotericin बी के साथ आंतरिक समाधान (1 टेबल) के पूरक: आंतरिक समाधान के 0.5 मिलीलीटर 2 मिलीग्राम / एमएल amphotericin बी का जायजा (DMSO में तैयार और छोटे aliquots में जमे हुए है और प्रकाश से संरक्षित रखा) की 3 μl जोड़ें. विंदुक टिप amphotericin बी मुक्त आंतरिक समाधान में सूई और फिर अन्य अंत पर एक 10 मिलीलीटर टयूबिंग की एक टुकड़ा (Tygon आर - के माध्यम से जुड़ा सिरिंज का उपयोग चूषण आवेदन amphotericin बी मुक्त आंतरिक समाधान के साथ पैच विंदुक की नोक भरें ) 3603. Amphotericin विंदुक बी युक्त समाधान एक Eppendorf Microloader पिपेट टिप का उपयोग कर जब तक विंदुक के बारे में आधा समाधान के साथ भरा है ऊपर से जोड़ें. धीरे विंदुक दोहन द्वारा किसी भी हवाई बुलबुले निकालें. तुरंत विंदुक का प्रयोग करें.
- में विंदुक डालेंइलेक्ट्रोड धारक और एक micromanipulator का उपयोग करने के लिए एक लम्बी myocyte (के करीब है, लेकिन नहीं नाभिक, चित्रा 2 के शीर्ष पर) की सतह विंदुक कम. जब विंदुक में 6-10 MΩ प्रतिरोध बढ़ जाती है, चूषण लागू करने के लिए एक giga मुहर (> 10 GΩ) को प्राप्त करने के लिए.
- सेट 0 mV वोल्टेज पकड़ जबकि झिल्ली वेध के लिए इंतज़ार कर रहे. 100 एमएस 10 mV वोल्टेज कदम और फिर -10 mV लागू, और एम्पलीफायर का उपयोग करने के लिए तेजी से विंदुक समाई यात्रियों क्षतिपूर्ति. पूरे सेल समाई यात्रियों, छोटे निरंतर सकारात्मक धाराओं (आमतौर पर 2-10 PA) की उपस्थिति के साथ समवर्ती कार्यात्मक Kv7 चैनलों की उपस्थिति का संकेत होगा.
- Amphotericin बी के साथ सफल वेध MΩ 35 या कम करने के लिए उपयोग प्रतिरोध कम हो जाएगा. वर्तमान रिकॉर्डिंग तो -4 mV होल्डिंग वोल्टेज से एक 5 सेकंड वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग शुरू किया जा सकता है. हम -4 mV धारण वोल्टेज का इस्तेमाल देरी आरईसी के अन्य प्रकार के अधिक से अधिक निष्क्रियता के पास प्राप्त करने केtifier पोटेशियम (KV1 और KV2 चैनलों द्वारा मुख्य रूप से मध्यस्थता) धाराओं है कि अन्यथा अपेक्षाकृत छोटे गैर निष्क्रिय Kv7 धाराओं की रिकॉर्डिंग दूषित होगा. लंबे समय (5 सेकंड) वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल Kv7 चैनल, जो धीमी गति से वोल्टेज - निर्भर सक्रियण और क्रियाशीलता छोड़ना एक्ज़िबिट सक्रियण स्थिर राज्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. निरंतर कदम वोल्टेज के दौरान Kv7 धाराओं नहीं निष्क्रिय करते हैं.
- रिकॉर्ड Kv7 संबंध वर्तमान वोल्टेज (चतुर्थ), 5 सेकंड -84 mV है, जिस पर खुला Kv7 चैनलों की संभावना कम है से लेकर voltages के लिए कदम वोल्टेज लागू करने के लिए, जिस पर 16 mV खुला Kv7 चैनलों की संभावना तक पहुँचता है पठार, 5 सेकंड के बाद प्रत्येक परीक्षण वोल्टेज में 10 सेकंड के लिए पकड़ वोल्टेज (-4 mV) वापस कदम. यह परीक्षण दालों (चित्रा 3 ए) की पूरी श्रृंखला के लिए लगभग 3.5 मिनट ले जाएगा. 2-3 नियंत्रण चतुर्थ रिकॉर्डिंग करने के लिए सुनिश्चित करें कि समय पर दर्ज धाराओं स्थिर रहे हैं प्रदर्शन. प्लॉट औसत अंत नाड़ी धाराओं (औसतपिछले 1 सेकंड के लिए दर्ज धाराओं) बनाम वोल्टेज एक चतुर्थ वक्र (चित्रा 3 डी) बनाने के लिए. नियंत्रण चतुर्थ घटता लगभग अगर धाराओं स्थिर रहे हैं आरोपित चाहिए.
- आवेदन करने से पहले किसी भी औषधीय एजेंटों का एक कोर्स करने के लिए लगातार -20 mV पर वर्तमान रिकॉर्ड के लिए डिजाइन प्रोटोकॉल आरंभ करें. वर्तमान के स्थिर रिकॉर्डिंग दवा आवेदन के लिए पूर्व कम से कम 5 मिनट के लिए सुनिश्चित करें. 5-15 मिनट के लिए या एक स्थिर राज्य (चित्रा 3C) हासिल की है जब तक औषधीय एजेंटों लागू होते हैं, तो समय बेशक प्रोटोकॉल और दो चतुर्थ घटता वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए रिकॉर्ड समाप्त. दवा वार्शआउट और दवा वार्शआउट के समय पाठ्यक्रम, दो अतिरिक्त चतुर्थ घटता की रिकॉर्डिंग के बाद रिकॉर्ड.
- प्रयोग के अंत में 10 सुक्ष्ममापी linopirdine या 10 XE991 सुक्ष्ममापी, Kv7 चैनलों के अपरिवर्तनीय inhibitors लागू होते हैं, इन दवाओं पूरी तरह से में -20 mV (चित्रा 3 डी) के लिए नकारात्मक voltages पर दर्ज धाराओं को बाधित करना चाहिए.
5. दबाव Myography लिए बरकरार धमनी अनुभाग का उपयोग
- एक दबाव myograph डैनिश Myo प्रौद्योगिकी (ए / एस DMT, डेनमार्क, मॉडल 110P) से खरीदी प्रणाली दबाव myography प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है. स्टेनलेस स्टील चैम्बर में एक अंत और दूसरे छोर में चल सही कांच प्रवेशनी में क्षैतिज तय बाएं कांच प्रवेशनी डालने से धमनी खंड माउंट. दो दबाव transducers (सही और बाईं ओर p2 पर P1) धमनी लुमेन भीतर दबाव की निगरानी में बनाया जाता है. सही कांच प्रवेशनी से द्रव अपनी अनुमानित शारीरिक स्तर धमनी के अंदर दबाव को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. शुरू करने के लिए, लुमेन समाधान (1 टेबल) के साथ एक खुले 10 मिलीलीटर सिरिंज (गुरुत्वाकर्षण फ़ीड दबाव स्तंभ के रूप में सेवारत), पूर्व भरने. सिरिंज उठाएँ समाधान धक्कासही कांच प्रवेशनी में polyethylene टयूबिंग, टयूबिंग या प्रवेशनी में हवाई बुलबुले से बचने के लिए देखभाल करने के लिए के माध्यम से tion. छोड़ दिया प्रवेशनी एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से लुमेन समाधान किया जाना चाहिए पहले से ही भरे. पोत स्नान समाधान (1 टेबल) के 10 मिलीग्राम के साथ दबाव myograph चैम्बर भरें. शिथिल प्रत्येक गिलास cannulae निकट पक्ष पर दो पूर्व बनाया ठीक नायलॉन sutures को स्थगित कर देते हैं.
- विदारक चैम्बर से खंड के एक छोर पर पकड़े माइक्रो का उपयोग करके दबाव myograph कक्ष - ध्यान dissected mesenteric धमनी (2.6 कदम से व्यास में 350 सुक्ष्ममापी आमतौर पर 200 के आसपास एक तीसरी 3 या 4 वें क्रम खंड) खंड हस्तांतरण संदंश.
- एक प्रबुद्ध विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से Visualizing, धमनी खंड के एक छोर पकड़ और धीरे बाईं कांच प्रवेशनी पर स्लाइड और नायलॉन sutures अंत का उपयोग कर सुरक्षित. धीरे घुड़सवार पोत लुमेन तरल पदार्थ के माध्यम से फ्लश पोत के भीतर रक्त और मलबे को हटाने के लिए.बाईं सिरिंज वाल्व तो बंद कर दिया तो यह है कि इस तरफ तरल पदार्थ की एक स्थिर स्तंभ के खिलाफ जो दबाव दाईं ओर से निकाला जाता है प्रस्तुत किया जाना चाहिए.
- Micromanipulator स्थिति का प्रयोग चल सही कांच प्रवेशनी धमनी खंड के करीब है और इस पर खंड के सही अंत खींच, अंत में यह नायलॉन sutures के साथ हासिल है. बंद अतिरिक्त सिवनी धागे क्लिप.
- दबाव myograph खुर्दबीन पर माउंट मंच पर दबाव myograph इकाई. दबाव myograph कक्ष पर कवर रखें. चैम्बर के लिए कवर superfusion इनलेट और चूषण इसे से जुड़ी पाइप शामिल हैं. कमरे के तापमान स्नान या 60 मिमी KCl समाधान गंभीरता से दबाव myograph कक्ष में superfusion की अनुमति देने के लिए कई गुना superfusion इनलेट कनेक्ट. दवाओं या हार्मोन है है कि पैच दबाना माप में पाए जाते हैं लिए Kv7 चैनल समारोह को प्रभावित के रूप में इस तरह के टेस्ट पदार्थों, नहाने के समाधान के लिए आम तौर पर सीधे स्नान के माध्यम से समर्थन नहीं, लागूया समाधान में लुमेन erfusion. स्नान समाधान की superfusion KCl समाधान धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक निर्वात प्रणाली के लिए सक्शन पाइप संलग्न लिए अतिरिक्त superfusate हटाने. स्नान समाधान में myograph चैम्बर कवर में प्रदान खोलने के माध्यम से तापमान संवेदक डालें.
- कनेक्ट दबाव myograph myo इंटरफ़ेस प्रणाली इकाई, हार्डवेयर (DMT) myoview सॉफ्टवेयर myograph इकाई के संचार के लिए सक्षम बनाता है.
- खोलें कंप्यूटर में myoview सॉफ्टवेयर. पैरामीटर विंडो में 35 डिग्री सेल्सियस के रूप में 1 के एक तापमान सहिष्णुता के साथ लक्ष्य तापमान सेट डिग्री सेल्सियस, लक्ष्य 80 mmHg और लक्ष्य 80 mmHg के रूप में बहिर्वाह दबाव के रूप में प्रवाह के दबाव. अंशांकन फाइल लोड और पोत बाहरी व्यास जांचना धमनी व्यास में परिवर्तन इतना है कि सही microns में दर्ज कर रहे हैं. पृष्ठभूमि के खिलाफ मुहिम शुरू की खंड का एक अच्छा दृश्य को सक्षम करने के लिए आवश्यक के रूप में इसके विपरीत समायोजित करें. कैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत विवरणDMT से उपयोगकर्ता के मैनुअल में प्रदान की जाती है.
- धीरे - धीरे 15 मिनट की अवधि से अधिक 10 मिलीलीटर सिरिंज (गुरुत्वाकर्षण फ़ीड दबाव स्तंभ के रूप में सेवारत) जुटाने तक P1 दबाव transducer 80 mmHg पढ़ता है. जबकि दबाव स्तंभ बढ़ाने, पोत में किसी भी लीक के लिए जाँच करें. अगर वहाँ किसी भी लीक कर रहे हैं, खंड त्यागने और अन्य धमनी खंड माउंट (5.2 से कदम दोहराने). Cannulae जब आवश्यक के बीच की दूरी को समायोजित करें. दूरी इस तरह है कि दबाव धमनी खंड लगभग सीधे (लेकिन) बढ़ाकर नहीं है और पैटर्न की तरह जहां संबंधों (4A चित्रा) बना रहे हैं एक कंधे रूपों में समायोजित किया जाना चाहिए.
- Myo इंटरफ़ेस प्रणाली में नियंत्रण माध्यम से दबाव myograph कक्ष की हीटिंग मुड़ें. स्नान समाधान धीरे - धीरे गर्म करने के लिए अनुमति दें जब तक यह 36-37 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचता है
- DMT खुर्दबीन उद्देश्य के xyz समायोजन जब पोत को ध्यान में रखने के लिए और चर्चा की सटीक ट्रैकिंग की सुविधा के लिए आवश्यक हैबाहरी पोत व्यास में anges.
- क्षणिक superfusion (~ 30 सेकंड) 60 मिमी KCl साथ घुड़सवार पोत की व्यवहार्यता की जाँच करें. KCl के अलावा एक व्यवहार्य पोत पर जल्दी constricts और 60 मिमी KCl (स्नान समाधान के लगभग 60 मिलीलीटर superfuse बाहर KCl धोने) की वार्शआउट पर तुरंत फैल जाती है. इस परीक्षण के बाद, स्नान समाधान के ठीक 10 मिलीलीटर मात्रा रद्दोबदल. स्नान के तापमान KCl परीक्षण और वार्शआउट के दौरान कम है क्योंकि इनमें से कोई भी समाधान कमरे के तापमान पर कर रहे हैं, लेकिन कुछ ही मिनटों के भीतर चैम्बर हीटर का तापमान 36-37 डिग्री सेल्सियस को बहाल करेंगे.
- धमनी को कम से कम 30 मिनट (व्यास कम से कम इस अवधि के अंतिम 10 मिनट के लिए स्थिर होना चाहिए) के लिए संतुलन में लाना करने की अनुमति दें. नहाने के समाधान के लिए ध्यान केंद्रित परीक्षण पदार्थ सीधे जोड़ें और आगे और पीछे स्नान समाधान में परीक्षण पदार्थ मिश्रण, 10 मिलीलीटर कक्ष मात्रा में उपयुक्त अंतिम एकाग्रता उपज चैम्बर के किनारों के पास धीरे विंदुक. चानपरीक्षण पदार्थ (ओं) के पोत व्यास निम्नलिखित अलावा में ges लाइव वीडियो छवि में नजर रखी जा सकती है और भी छवि विश्लेषण विंडो में सनदी जबकि प्रयोग प्रगति में है.
- प्रयोग के पूरा होने के बाद, संग्रहीत डेटा फ़ाइल (* myo.) आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में खोला जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 3 ए, बी, 3 चित्र में दिखाया परिणामों mesenteric धमनी myocytes से Kv7 धाराओं और पहले (चित्रा 3A, बी काला निशान) दौरान एक Kv7 चैनल उत्प्रेरक Zn pyrithione (ZnPyr, 100 एनएम के साथ इलाज के एक वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर के विशिष्ट रिकॉर्डिंग वर्णन लाल निशान). 3 कोशिकाओं से समान वोल्टेज कदम डेटा वर्तमान वोल्टेज (चतुर्थ) चित्रा 3 डी में दिखाया गया भूखंडों तैयार औसतन थे. वर्तमान आयाम में वृद्धि का एक प्रतिनिधि समय कोर्स (-20 mV में निरंतर वोल्टेज क्लैंप द्वारा मापा) ड्यूरिन100 एनएम Zn pyrithione के साथ छ उपचार चित्रा 3C में दिखाया गया है 4B चित्रा mesenteric धमनी बाहरी दबाव myography का उपयोग करके मापा व्यास पर ZnPyr के प्रभाव के समय पाठ्यक्रम दिखाता है, पोत 100 PM arginine वैसोप्रेसिन (AVP) के साथ पूर्व constricted था पूर्व अलावा 100 एनएम ZnPyr के. प्रेरित ZnPyr mesenteric धमनी फैलाव के लिए औसतन खुराक - प्रतिक्रिया डेटा चित्रा 4C में दिखाए जाते हैं.
चित्रा 1 विदारक कक्ष में एक mesenteric आर्केड का चित्र.
चित्रा 2 इसकी सतह पर एक पैच विंदुक के साथ एक myocyte का चित्र.
चित्रा 3 Kv7 धाराओं, दवाओं के समय पाठ्यक्रम के मूल निशान आवेदन, चतुर्थ घटता. अनुक्रमिक वर्तमान (कम पैनल) निशान इलाज से पहले वोल्टेज (शीर्ष पैनल) कदम (नियंत्रण, काले) और एक एकल MASMC में 100 एनएम ZnPyr (लाल) की उपस्थिति में निम्नलिखित स्थिरीकरण के लिए जवाब में दर्ज ए परिवार. बी प्रतिनिधि से वर्तमान निशान नियंत्रण (काला) के लिए और 100 एनएम ZnPyr (लाल) के लिए एक (arrowheads द्वारा संकेत). ग्रे सलाखों समय अंतराल जहां औसत वर्तमान amplitudes वर्तमान वोल्टेज (चतुर्थ) के भूखंडों के लिए मापा गया संकेत मिलता है. चरण voltages सही पर arrowheads द्वारा संकेत कर रहे हैं. सी. Kv7 100 एनएम ZnPyr द्वारा वर्तमान वृद्धि के समय पाठ्यक्रम -20 mV (बार) में निरंतर वोल्टेज क्लैंप के साथ मापा. डी. औसत चतुर्थ (n 3 =) घटता Kv7 वर्तमान घनत्व से व्युत्पन्न पहले दर्ज (नियंत्रण, भरा हलकों) 100 एनएम (खुला हलकों) ZnPyr, के साथ इलाज के दौरान और 10 XE991 सुक्ष्ममापी (भरा त्रिकोण) के साथ इलाज के दौरान. गैर विशिष्ट रिसाव धाराओं थे घटाया Passmore एट अल द्वारा वर्णित 1.
चित्रा 4 100 PM AVP साथ पूर्व constricted एक mesenteric धमनी की ZnPyr प्रेरित विश्राम. Mesenteric धमनी की ए तस्वीर दबाव myograph में सेट अप मुहिम शुरू की. बी पोत के बाहरी व्यास में परिवर्तन की 100 एनएम ZnPyr (भरा बार) के आवेदन के बाद 100 PM AVP (खुला बार) के आवेदन के जवाब में समय बेशक. सी. बार ग्राफ 100 एनएम ZnPyr प्रेरित vasodilaion के परिणामों का सारांश.
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Discussion
तरीकों और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित काफी मजबूत हैं और स्पष्ट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का उत्पादन जब विस्तार करने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान के साथ लागू किया जा सकता है. अच्छा electrophysiological रिकॉर्डिंग और कसना / धमनी खंडों के फैलाव कोशिकाओं और धमनी खंडों के स्वास्थ्य पर निर्भर कर रहे हैं, क्रमशः. सेल की तैयारी के दिन से दिन में भिन्न हो सकते हैं, यहां तक कि एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं. अलगाव समाधान 2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अगर सेल तैयारी की गुणवत्ता दो फलस्वरूप दिनों पर कम है नई अलगाव समाधान के लिए तैयार किया जाना चाहिए. हमने पाया है कि एंजाइम गतिविधियों बैच से बैच और इसलिए अलगाव शर्तों (ऊष्मायन और एंजाइमों की सांद्रता के समय) के लिए अलग अलग एंजाइमों के प्रत्येक नए बैच के साथ अनुकूलन की आवश्यकता होती है. हम यह भी पाया है कि सेल अलगाव चूहे mesenteric धमनी के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य संवहनी बेड या अन्य प्रजाति है, जो एक अलग मिश्रण या भट हो सकता है के लिए इष्टतम नहीं हैबाह्य मैट्रिक्स घटकों के अल्पसंख्यक. प्रत्येक संवहनी तैयारी अपने स्वयं के अनुकूलन के लिए स्थिति है कि स्वास्थ्यप्रद कोशिकाओं का उत्पादन की पहचान की आवश्यकता है. मानदंड है कि हम स्वस्थ कोशिकाओं की पहचान करने में सबसे उपयोगी पाते हैं) 1 सेल आकारिकी: अलगाव समाधान युक्त 50 सुक्ष्ममापी 2 Ca में एमए खंडों triturating +, और एक ही उपस्थिति को बनाए रखना है, जब 2 करने के लिए हस्तांतरित करने के बाद चिकनी, लम्बी है, लेकिन थोड़ा constricted उपस्थिति मिमी Ca 2 + युक्त बाहरी समाधान. नहीं सभी कोशिकाओं उनके लगभग पूरी तरह से आराम लम्बी आकार बनाए रखने के लिए, लेकिन केवल लगभग पूरी तरह से आराम myocytes electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, 2) कोशिकाओं ऑप्टिकली घने होना चाहिए, जो एक अक्षुण्ण undamaged झिल्ली इंगित करता है, 3) स्वस्थ myocytes के आराम झिल्ली voltages के लिए इस्तेमाल किया रिकॉर्ड पोटेशियम धाराओं या झिल्ली वोल्टेज की वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के लिए -40 mV से अधिक नकारात्मक होना चाहिए (आमतौर पर -45 mV की ईओण des शर्तों के तहत -56 mV रेंज मेंहमारे यहाँ प्रोटोकॉल में cribed).
सफल electrophysiological रिकॉर्डिंग, स्नान के समाधान और विंदुक समाधान (संरचना के लिए देखें तालिका 1) प्रयोग के दिन पर तैयार किया जाना चाहिए सुनिश्चित करते हैं. यह दोनों आंतरिक और स्नान समाधान के osmolality के समान हो (298-299 mOsM) को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
समदाब रेखीय धमनी समारोह छोटे धमनियों (<500 सुक्ष्ममापी) दबाव myography अधिक अनुमानित बारीकी से शारीरिक स्थितियों से isometric बल के मापन का उपयोग में किए गए माप एक तार myograph का उपयोग कर बनाया है. वाहिकाओं एक दबाव myograph में आम तौर पर कर रहे हैं vasoconstrictor 2-4 agonists, और अधिक बारीकी से vivo 5, 6 में मापा संवेदनशीलता approximating के प्रति संवेदनशील हैं. agonists की कम मात्रा के लिए बढ़ा संवेदनशीलता संकेत पारगमन तंत्र की पहचान AVP की physiologically प्रासंगिक picomolar सांद्रता द्वारा प्रेरित सक्षम है7, 8.
दबाव myography पोत की ज्यामिति को बरकरार रखता है और endothelium की अखंडता को बनाए रखता है. दवाओं के अन्तःस्तर मध्यस्थता प्रभाव बरकरार और endothelium denuded 9 वाहिकाओं में समानांतर माप द्वारा आयोजित चिकनी मांसपेशी मध्यस्थता प्रभाव से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. endothelium के जानबूझकर व्यवधान शारीरिक रूप से endothelium (लुमेन के माध्यम से आगे और पीछे एक मानव बाल से गुजर रहा उदाहरण के लिए) को नुकसान पहुँचाए या perfusing धमनी के लुमेन के माध्यम से हवा के द्वारा पूरा किया जा सकता है. endothelial समारोह (लेकिन नहीं संवहनी चिकनी मांसपेशी समारोह) के नुकसान के एक कम endothelium की मध्यस्थता vasodilator एक 9 agonist साथ पूर्व constricted वाहिकाओं में acetylcholine प्रतिक्रिया को मापने के द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए.
ईओण mesenteric धमनी myocytes में / झिल्ली वोल्टेज धाराओं के समानांतर माप पैच दबाना तकनीक और धमनी कसना / mesenteric arteri के फैलाव का उपयोगदबाव myography का उपयोग कर तों दोनों शारीरिक संकेत transduction cascades में और चिकित्सीय एजेंटों की कार्रवाई में विशिष्ट आयन चैनल की भूमिका की व्याख्या के लिए सक्षम कर सकते हैं. आयन चैनल या विशिष्ट संकेत पारगमन मध्यवर्ती के विशिष्ट वर्गों को लक्षित उपचार additively या अनुक्रम में लागू किया जा सकता myocyte समारोह के नियमन में सेलुलर स्तर पर और कसना / बरकरार धमनियों के फैलाव में इन चैनलों की भूमिका के बारे में यंत्रवत जानकारी प्रदान करते हैं. उपचार है कि बढ़ाने या धमनी व्यास पर इसी प्रभाव के साथ ईओण धाराओं के विशेष प्रकार को बाधित संमिलित परिणाम और अधिक विश्वसनीय व्याख्या की तुलना में खुद के द्वारा किसी भी विधि का उपयोग कर प्राप्त कर सकते हैं प्रदान करते हैं. आदर्श रूप में, अध्ययन के तहत एजेंटों की एकाग्रता निर्भरता दोनों प्रणालियों में निर्धारित किया जाना चाहिए. शारीरिक या चिकित्सकीय प्रासंगिकता का मूल्यांकन, परीक्षण सांद्रता शारीरिक पर्यावरण ओ में मापा सांद्रता से संबंधित होना चाहिएr नैदानिक चिकित्सा के साथ हासिल की. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के इन प्रकार के उदाहरण हमारे पिछले प्रकाशनों 8-10 में पाया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम KLB और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (09PRE2260209) और आर्थर जे Schmitt BKM फाउंडेशन से पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (एनआईएच R01 HL089564) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145 |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7 |
| Potassium EGTA | Sigma | E4378 | Internal solution for electrophysiology: 0.05 |
| HEPES | Sigma | H9136 | Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10 |
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma | S5136 | Isolation solution for myocytes*: 0.34 |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma | P5655 | Isolation solution for myocytes*: 0.44 |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2393 | Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2 |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05 |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | BP331-1 | Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2 |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17 |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3 |
| Pyruvic acid | Sigma | P4562 | Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2 |
| EDTA dihydrate | Research Organics | 9572E | Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02 |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5 |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3912 | Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1% |
| pH | Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4 |
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| Osmolarity | Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300 |
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*11 |
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Table 1. Components of solutions used in the experiment. |
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References
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