Summary
プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖
Abstract
神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞の in vitro での展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+（GalC）及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞（OPC）の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性は 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。
初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系（CNS）の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞（前駆細胞由来のニューロンは、PDN）とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro で増殖（前駆細胞由来アストロサイト、PDA）、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階（前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO）の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF-AA）、ソニックヘッジホッグ（Shh）、神経栄養因子（NT-3）、N-2とトリヨードサイロニン（T3）とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子（GF）（bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3）を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質（MBP）。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。
Protocol
注：神経前駆細胞とoligodendrocytic系統細胞の培養ルーチンについては、インキュベーションを37℃で加湿した5％CO 2雰囲気で行った。 2日毎に、培地は、培養40〜70％コンフルエントであれば、新鮮な培地の50〜100％を使用して置き換えられます。近くコンフルエントの時点では、培養は通常、毎週のスケジュール上で2-2.5e6/T75フラスコで継代されています。
1。コーティングされたフラスコを準備
- コートフラスコを準備するには、暗所で室温でPDLの50μg/ mlの（RT）でコートT75フラスコをその後、100mlの脱イオン水（脱イオン水）にポリ-D-リジン5mgの（PDL）を希釈してください。 1つの½時間後、PDLを吸引し、DI水で一度フラスコをすすいでください。セル（ 表1）播種前に、乾いたフラスコましょう。
2。前駆細胞由来のオリゴデンドロサイトへの神経前駆細胞の分化の開始（PDO）
のプロトコルです以前の刊行物に記載されている人間の中枢神経系前駆細胞をオレート、それがこのプロトコル1の一部ではありません。人間の中枢神経系前駆細胞はNIHガイドラインに従って得られた8週間の妊娠胎児の脳の終脳から単離された。
- 25 ng / mlのbFGFの、20 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）（ 図1A）を補ったNeurobasal培地におけるPDL コートフラスコ上の神経前駆細胞の多能集団を栽培しています。通路11（P11）よりも高い場合は、それらを使用しないでください。
- 文化は約70％コンフルエントのとき神経前駆細胞を区別するために開始します。
- ウシ血清アルブミン、L-グルタミン、ゲンタマイシン、N2のコンポーネントは、T3に、Shh、NT-3は、bFGF、およびPDGF-AAを（ 表1）を補充した無血清DMEM / HAMS F12を1:1の培地を使用して完全な分化オリゴデンドロサイト培地を作る。この培地は、増殖因子（オリゴ培地+ GF）とオリゴ媒体として定義されます。
- PROGENを削除フラスコからデンサメディアは、で一度細胞をリンスリン酸緩衝食塩水（PBS）は、その後オリゴmediumを追加+ GFオリゴデンドロサイト分化を開始する（2.3で説明されるように詳細）。 oligodendrocytic系統にコミットした細胞のみが（ 図1B）成長していきます。 3週間この培地で細胞を培養。
- 毎週、細胞が90〜95％のコンフルエンス、通路、それらをトリプシン（0.05％）-EDTA（0.1％）（T75フラスコのための4ミリリットル）を使用してであるとき。 50 mlコニカルチューブに継代される細胞から、媒体全体を転送し、この馴化培地はトリプシンをクエンチするために使用されます。細胞を乾燥しないようにしてください。その後トリプシンを追加します。
- 優しく細胞の剥離を助けるためにフラスコを数回タップする、室温で5分間トリプシンで細胞をインキュベートします。
- デタッチされた細胞を用いたフラスコに馴化培地の4-5 mlを加えてトリプシンをいやす。
- 培地と同じ50 mlコニカルチューブに細胞を移します。 1,200 rpmで（〜に培地と細胞を遠心室温で5分間、300×g）で。
- 上清を吸引し、穏やかにチューブを転倒し、細胞ペレットを再懸濁し、その後新鮮なオリゴ培地+ GFを追加します。優しく均一な細胞懸濁液を作るには、上下の培地および細胞をピペット。
- セルをカウントし、各新しいPDLでコーティングされたT75フラスコに2.5e6を転送します。
3。オリゴデンドロサイトの分化における最終ステップ
- オリゴ培地+ GF、細胞が70〜80％コンフルエントにある文化の3週間後、分化の最終工程（ 図1C）を起動します 。
- Shhは、NT-3、bFGFおよびPDGF-AA：オリゴ培地+ GFとしてではなく、4 GFを追加することなく、同じようにメディアを準備します。 GF - 4 GFなしでこの媒体はオリゴ媒体として定義されます。
- フラスコからオリゴ培地+ GFを吸引除去し、PBSで一回すすぎ、その後培地16ミリリットルの全容量を追加して、オリゴ媒体である¾（12ミリリットル）の - GFと¼（4ml）をPDN馴化培地である、のために6-10日）。 PDNからの馴化培地の使用は、分化過程に、または、細胞の生存に重要ではない。我々は実際には共培養実験のPDN細胞とPDOの唯一の直接接触はPDO生存の長さに影響を与えたことを観察した。オリゴ培地で生存期間 - PDOの細胞は、PDN細胞と共培養している場合はGFは2または3週間に延長することができます。 PDNにヒト神経前駆細胞を区別するためのプロトコルは、以前の刊行物に記載されており、このプロトコル1の一部ではありません。複数のプロセス（ 図1D）を持つ細胞の徐々に分化した培養における培地の結果から成長因子撤退。
4。フローサイトメトリーアッセイ
フローサイトメトリーアッセイは、彼らの親の人口のものとの関係では、分化過程の間にオリゴデンドロサイトマーカーの取得を比較します。
- 神経Proを使用コントロールとしてgenitors。オリゴ培地+ GFのポリ-D-リジンで被覆した2 T75フラスコ中に2.5×10 6個の細胞でシードPDOの細胞。
- GF - 他のフラスコは、オリゴ媒体を持っていた一週間後、細胞の生存のための対照培養フラスコのように新鮮なオリゴ培地+ GFで培地を交換してください。
- 両方のメディアにPDO細胞を解離させるためには20 U / mlのパパインおよびトリプシンを使用していない。パパインは、細胞の形態を維持解離中の細胞上の穏やかな効果を持っているためです。
- パパインバイアルにアールの平衡塩類溶液（EBSS）5mlを加える。 10分間またはパパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで37℃でバイアルを置きます。これは、細胞を解離させるために使用されるパパインソリューションです。
- リボヌクレアーゼI（DNase処理）バイアル（ 表1）にEBSSの0.5 mlを加える。静かに混和します。溶解パパインのバイアルにこの溶液0.25mlを加える。この製剤は、約20 U / mlのパパインと0の最終濃度が含まれています0.005パーセントのDNase。
- 15〜30分間37℃でインキュベートした細胞の上に置いパパイン溶液（上記のように）;顕微鏡を用いて細胞の剥離を監視します。 7分間1200 rpmでGFと遠心の有無にかかわらず培地5mlで反応を停止します。
- 二つの異なる5 mlのポリプロピレンチューブに両方のフラスコから細胞ペレットを転送し、通常の生理的媒体（NPM：145 mMのNaCl、5mMのKCl、1.8 mMのCaCl 2、10mMのHEPESおよび10mMグルコース）でそれらを洗って1 mg / mlのを補足したウシ血清アルブミン（NPM + BSA）。
- 表面は4で免疫染色実行°GalC（ 表2）、A2B5、O4のために具体的かつ適切に滴定した一次抗体を用いて20分間インキュベートする。
- 5分間、4℃で、NPM + BSAで細胞を洗浄し、20分（ 表2）4℃で特異的な二次抗体を用いて、それらをインキュベートする。
- ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、クラスIIIとなるなど、細胞内抗原を染色するTA;-チューブリン、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）（ 表2）は 、室温で20分間、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定し、-20℃で15分間冷70％エタノールで透過処理
- 1×PBSで細胞を洗浄し、特定の二次抗体（ 表2）でインキュベートする。
- フローサイトメトリー分析の際に無傷の細胞および細胞内残骸を区別するために、4,6 - ジアミジノ-2 - phenyllindole、二塩酸塩（DAPI）（ライフ·テクノロジーズ、Grand Island、NY）を用いて細胞を染色します。
- 上記のプロトコルを最適化する際に、我々はそれぞれの免疫試薬の特異性を確認するためにすべての適切な制御実験を行った。簡単に言えば、直接標識抗体について、適切な陰性対照は、一次抗体（ すなわち 、アイソタイプコントロール）と同じ免疫グロブリンアイソタイプクラス（またはサブクラス）と蛍光色素複合体の直接抱合抗体であった。一次抗体の間接免疫染色、適切なネガティブコントロールwの具体的に一次抗体が生成されたホストの免疫グロブリンクラス（またはそのサブクラス）を標的とし、目的の蛍光色素に共役二次抗体として。複数のホストから一次抗体（マウス、ウサギ、ニワトリ）が、我々は、各ホストの一次抗体を標的とする二次抗体を使用した、一緒に使用され、使用されるそれぞれの二次抗体は、一般的に最小化するために、他のホストからの免疫グロブリンに対するクロス吸着させたときにクロス宿主の免疫反応。ポジティブコントロールは、これらの抗原に特異的な一次抗体との直接的または間接的な免疫反応のいずれかを使用して、目的の抗原を発現することが知られている細胞調製物の直接的または間接的な免疫染色が含まれていた。上記の最適化の方法は、実験を免疫染色の種類ごとに一回行った。コントロール免疫反応は、一次抗体および二次抗体の間に有意クロスエピトープ免疫反応性がないことを明らかにした。フローサイトメトリーを用いて、均一について行ったFACVantage SEセルソーター（BD Biosciences社、サンノゼ、CA）を使用して、一時停止され、蛍光標識された細胞は、488nm、647 nm、および広範な紫外線（351から364 nm）を（ 図2）に同調励起波長を提供する3つのレーザーを装備。
5。免疫蛍光検査法
注： - PDLでコーティングされた6ウェルプレートで2.5e5でGFの免疫蛍光実験では、PDOはオリゴ培地+ GFまたはオリゴ培地にプレーティングする。細胞は、成長因子の撤退後の様々な時点で2％PFAで固定されています。抗体染色は、プラスチック製6ウェルプレートの代わりにガラスカバースリップ上で実行されます。
- メディアを取り出し、2％PFAを追加します。室温で10分間インキュベートする。 PFAを捨てる。 PBSで各5分間の時間で細胞を3回洗浄する。細胞を乾燥しないように注意してください。
- 室温で10分間、PBS中の0.25％トリトン溶液を用いて、細胞内マーカーのために、細胞を透過。
- 非特異的結合をブロック細胞を防止するために、FまたはHHG（1 mMのHEPES緩衝液、2％ウマ血清、ハンクス平衡塩溶液中で10％ヤギ血清）で10分。 HHGで予め決められた濃度になるように具体的な一次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した抗体を置きます。シェーカー上または4℃で一晩、室温で1時間インキュベートします。
- 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。 HHGで予め決められた濃度に蛍光色素と結合し、適切な二次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した二次抗体の混合物を置きます。暗闇の中でシェーカー上で室温で1時間インキュベートします。
- 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。
- 退色を避けるために細胞にDAPIで金を延長し、それらの上にカバーガラスを配置し、10μlを添加する。 AXIOVERT 200M蛍光顕微鏡（ツァイス、ソーンウッド、ニューヨーク州）（ 図3）を用いて標識した細胞を可視化します。
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Representative Results
それは70％-80％コンフルエント神経前駆細胞培養（ 図1A）から分化プロセスを開始することが非常に重要です。多くの細胞は、それが特定の成長因子が含まれているため、前駆細胞からオリゴ培地に培地を変更した後に消えてしまうでしょう。これはoligodendrocytic表現型にコミットされていない神経前駆細胞の増殖は新しい媒体（ 図1B）によってサポートされないことを示します。一週間オリゴ培地+ GFのインキュベーションは、狭い、バイポーラの形態を（ 図1B）を示す中間の文化をもたらした。細胞はオリゴ培地+ 3-4週間（ 図1C）のGFに保存されています。培養培地から増殖因子の撤退は、複数のプロセス（ 図1D）で細胞の分化した徐々に文化をもたらした。フローサイトメトリーは、データの定量的な表現のために使用されます。
図2A、2唯一の小さな亜集団は、アストロサイトマーカーGFAP（ 図2A）、神経マーカークラスIIIβ-チューブリン（ 図2B）などの系統制限的マーカーを発現し、一方Bおよび2Cは、神経前駆細胞の大部分が上皮幹細胞マーカーであるネスチンを発現することを実証する、またはオリゴデンドロサイトマーカーO4（ 図2C）。オリゴ培地+ GFと細胞を1週間培養した後に培地を交換した際に、ネスチンの発現を減少させ、A2B5発現する（ 図2D）観察することができます増加した。 A2B5は、グリア前駆マーカーである。比較では、2週間培地交換した後、ネスチンの発現はさらに減少し、単独でA2B5発現は増加した（ 図2E）ならびに他のオリゴデンドロサイトマーカーO4（ 図2F）の発現。二日後の成長因子の撤退、O4の発現は、同様GalCの発現を増加させた後期オリゴデンドロサイトマーカー（ 図2G）。六日後に成長因子の撤退は、O4およびGalCの共発現は増加した（ 図2H）及びGalCおよびMBP（ 図2I）の共発現に匹敵するものです。マルチエピトープ免疫染色より、培養中の細胞の半分以上がMBPを（ 図2J）を発現していることがわかります。 PDOの分化のさらなる証拠は、成長因子の撤退（ 図3A-C）の後に、これらの細胞におけるMBPの発現を一時的に増加することによって、免疫蛍光アッセイを用いて、特徴づけられた。要するに、ヒト胎児神経前駆細胞は3つの主要な脳細胞の種類（ 図4）に分化する能力を維持しながら、 インビトロで増殖することができます。
図1位相コントラスト顕微鏡Of（）の前駆細胞培地で培養した神経前駆細胞、（B）週オリゴ培地+ GFに成長した神経前駆細胞が変化した狭い、バイポーラの形態を示す;オリゴ培地中で3日間増殖させた（C）の差別化された前駆細胞由来のオリゴデンドロサイト成長因子の撤退後、複数のプロセスによって特徴付けオリゴデンドロサイトの形態を示す。 20倍の倍率。
。神経前駆細胞を共発現する前駆細胞のマーカーであるネスチン（すべて縦軸）の2つのフローサイトメトリー分析図（A）アストロサイトマーカーGFAP、（B）神経マーカーβIIIチューブリンと、（C）oligodendrocyticマーカーO4（D）神経前駆細胞は、オリゴメディアで週に成長+ GFを共発現nestinおよびA2B5、（E）ネスチンおよびA2B5共発現オリゴ培地+ GF（F）A2B5およびO4オリゴ培地+ GFの神経前駆細胞の成長の2週間後の共発現における神経前駆細胞の成長の2週間後に、（G）の 2成長因子撤退した数日後、分化、O4およびGalCの異なるオリゴデンドロサイトマーカーは、発現される。 GalCとMPBのダブルポジティブ（I）;;シックス成 長因子撤退後の日数（H）細胞の増加割合はO4およびGalCのための二重陽性であると（J）ダブルポジティブO4とMBPのために。 AJは4つの独立した実験の代表である。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3間接immunofluorMBPのための前駆細胞由来のオリゴデンドロサイト（）2日、（B）は 5日、（C、D）の 9日間増殖因子撤退後のescence染色。 （D）はオリゴ培地中で9日間培養の位相画像を表します- GFとは、（E）は同じ画像のホワイトボックスの拡大図である（A、B）は 20倍の倍率、（C、D）の 32倍の倍率。
図4：私たちの細胞培養モデルの模式図。その可塑性を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞を in vitro で増殖する。異なる培養条件を用いて、神経前駆細胞がニューロン（PDN）、アストロサイト（PDA）やオリゴデンドロサイトに分化することができる（PDO）、などの特定によって示さdifferentiatイオンマーカー。
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Discussion
このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されている。しかし、in vitro の実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを得ることは、それが成人のヒト白質5月13日からのグリア前駆細胞を同定および単離することが可能であるにもかかわらず、依然として困難である。オリゴデンドロサイトを14から21を産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化を誘導するために様々な培養条件の開発で異なった試みがなされてきた。このプロトコルは、トン、選択成長因子（PDGF-AAは、bFGFに、Shh、およびNT-3）を補充した無血清培地で3週間生育させたときに-04マーカー（ 図2）を発現するネスチン陽性神経前駆細胞をさらに詳しくしたもの帽子は、オリゴデンドロサイト前駆22から24の増殖および生存に不可欠である。 O4 +細胞におけるこれらの成長因子の除去は、ミエリン成分（ラクトセレブロシドおよびMB）のさらなる差別化と発現をもたらした。さらに、オリゴデンドロサイト分化マーカーの発現は、最初はよく発達したプロセス（ 図1C）を持つ多極になる細胞に狭いとバイポーラ（ 図1B）が登場している細胞から形態学的変化と一致している。さらに分化の最終ステップを可能にする成長因子の除去は、両方のマウスとヒト15,25で行われた研究に基づくものであった。我々は4つの成長因子の除去が分化の最終マーカーの発現に必要であったことを観察しながら、トリヨードサイロニン（T3）の存在は、オリゴデンドロサイト26の生存と分化に重要である。これは、オリゴ培地+ GFに保たれた細胞と比較したSA制御。
我々はこのようなShhとbFGFの24のような信号に応答して、オリゴデンドロサイト細胞に多能性神経前駆細胞の分化を説明する最初ではありません。以前のレポートでは、10週間の周り皮質oligodendrogenesisが始まる胎週数22に比例して増加するミエリン化するヒト胎児オリゴデンドロサイトの容量を持つ人間24の在胎週数を示した。神経前駆細胞からのガラクトセレブロ+とO4 +オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化は、妊娠中期胎児脳21,27を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しない、文化21で時間をかけて迅速に失われます。我々のシステムは8週間から+とMBP +細胞、ヒト胎児培養から在胎週数をGalCの形成をサポートしています。さらに我々は記載されているdiffere神経細胞との共培養、分化、オリゴデンドロサイトの生存期間を延ばすこともできますがntiatedオリゴデンドロサイトは、星状膠細胞またはニューロンとして支持細胞を必要とせずに、in vitroで培養することができる。このプロトコルの1つのより多くの利点は、その表現型を維持しながら、週間の培養で増殖し、継代することができるO4 +マーカーを発現する細胞の多数を育成する可能性である。成長因子を培地から除去されたとき、その時点でそれらO4 +細胞は分化の最終段階でさらにプッシュすることができます。このホワイト·ペーパーで説明プロトコルは 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜のニーズに対応します。また、由来オリゴデンドロサイト前駆細胞に向かって神経前駆細胞の分化カスケードを誘発する特定の因子の同定は、発達の細胞および分子機構を理解する上で重要であると信じている遷移します。また、そのようなJCVなどのヒト神経向性ウイルスの病因に関連性脱髄性疾患やウイルス - 宿主細胞の相互作用を研究するための重要なツールとして機能することができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、米国立衛生研究所（NIH）、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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References
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