Primær, menneskelige hjernens-deriverte, multipotential stamceller sprer<em> In vitro</em> Mens opprettholde evnen til å differensiere til neuroner og astrocytes. Dette arbeidet viser at nevrale stamceller kan bli overtalt til å skille gjennom stadier av oligodendrocytic avstamning av condition med utvalgte vekstfaktorer.
Differensiering av menneskelige nevrale stamceller i neuronal og glial celletyper tilbyr en modell for å studere og sammenligne molekylær regulering av neural celle avstamning utvikling. In vitro utvidelse av nevrale stamceller fra foster CNS vev har blitt godt karakterisert. Til tross for identifisering og isolering av glial stamfedre fra voksent menneske sub-kortikal hvit materie og utvikling av ulike kultur betingelser for direkte differensiering av fosterets nevrale stamceller i myelin produserende oligodendrocytes, anskaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for in vitro eksperimentering er fortsatt vanskelig. Differensiering av galactocerebroside + (GalC) og O4 + oligodendrocyte forløper eller stamceller (OPC) fra nevrale forløper celler er rapportert ved hjelp andre trimester fosterets hjerne. Men disse cellene ikke sprer i fravær av støtte celler inkludert astrocytes og nerveceller, og er tapt raskt over tid i kultur. Behovet fortsatt for en kultur-system for å produsere celler av oligodendrocyte avstamning egnet for in vitro forsøk.
Dyrkning av primære humane oligodendrocytes kunne, for eksempel, være en nyttig modell for å studere patogenesen av neurotropisk smittestoffer som menneskelige polyomavirus, JCV at in vivo infiserer disse cellene. Disse dyrkede celler kunne også gi modeller av andre demyeliniserende sykdommer i det sentrale nervesystemet (CNS). Primær, human fosterets hjerne-avledet, multipotential nevrale stamceller sprer in vitro og samtidig opprettholde evnen til å differensiere i nevroner (stamfar-avledet nevroner, PDN) og astrocytes (stamfar-avledet astrocytes, PDA) Denne studien viser at nevrale stamceller kan induseres å skille gjennom mange av de stadier av oligodendrocytic avstamning utvikling (stamfar-avledet oligodendrocytes, PUD). Vi kultur nevrale stamceller i DMEM-F12 serum-frie medier supiverksatt med grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), blodplate avledet vekstfaktor (PDGF-AA), Sonic pinnsvin (SHH), neurotrop faktor 3 (NT-3), N-2 og trijodtyronin (T3). Dyrkede celler passaged på 2.5e6 celler per 75cm kolber omtrent hvert sju dager. Ved hjelp av disse forhold, flertallet av celler i kultur opprettholde en morfologi preget av få prosesser og uttrykke markører av pre-oligodendrocyte celler, for eksempel A2B5 og O-4. Når vi fjerner de fire vekstfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) og legge kondisjonert medium fra PDN, cellene begynner å anskaffe flere prosesser og uttrykke markører spesifikke for oligodendrocyte differensiering, for eksempel GalC og myelin grunnleggende protein (MBP). Vi utførte fenotypisk karakterisering ved hjelp av flerfarget flowcytometri å identifisere unike markører for oligodendrocyte.
Denne protokollen beskriver hvordan man utlede fosterets oligodendrocytes fra primære humane nevrale stamceller og karakterisere deres fenotype med både flowcytometri og immunfluorescens flekker. Utvidelsen og vekst av nevrale stamceller fra foster CNS har vært veldig godt beskrevet 1-4. Imidlertid, å skaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for in vitro eksperimentering fortsatt vanskelig, selv om det er mulig å identifisere og isolere glial forløpere fra voksen human hvit …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program ved National Institutes of Health, NINDS. Forfatterne ønsker å takke alle medlemmene av Laboratory of Molecular Medicine og nevrovitenskap, Rick Dreyfuss for å hjelpe med mikroskopi og Pamela C. sikting for å hjelpe med redigering.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |