Summary
İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler çoğalmaya
Abstract
Nöronal ve glial hücre tipleri içine insan nöral ataları Farklılaşma nöral hücre soyu gelişmenin moleküler düzenlenmesi incelemek ve karşılaştırmak için bir model sunuyor. Fetal MSS dokusu nöral progenitörlerinin vitro genişlemesi de karakterize edilmiştir. In vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit edinme miyelin üreten oligodentrositlere fetal nöral ataları, doğrudan farklılaşma çeşitli kültür şartlarının yetişkin insan subkortikal beyaz cevher ve geliştirme glial progenitörlerin tespiti ve izolasyonu rağmen zor kalır. Galactocerebroside + (GalC) ve O4 Farklılaşma + oligodendrosit habercisi veya nöral prekürsör hücrelerden progenitör hücrelerin (OPC) ikinci trimesterde fetal beyin kullanarak rapor edilmiştir. Ancak, bu hücreler astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere destek hücrelerin yokluğunda çoğalırlar yok, ve kültür zaman içinde hızla kaybolur. Gerek in vitro deneyler için uygun soy oligodendrosit hücreleri üretmek için bir kültür sistemi için devam etmektedir.
Primer oligodendrosit insan kültürü, örneğin, in vivo olarak bu hücreleri enfekte eden insan polyomavirus, JCV gibi nörotropik bulaşıcı ajanların patogenezine incelemek için yararlı bir model olabilir. Bu kültür hücreleri aynı zamanda merkezi sinir sistemi (MSS) diğer demiyelinizan hastalıkların modelleri sağlayabilir. Nöronlar (progenitör türetilmiş nöronlar, PDN) ve astrositler (progenitör türetilmiş astrositler, PDA) Bu çalışmada nöral ataları ikna edilebilmesi göstermektedir içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential nöral progenitör hücrelerin in vitro prolifere oligodendrocytic soy geliştirme aşamaları (progenitör türetilmiş oligodendrosit, PDO) birçok yoluyla ayırt etmek. DMEM-F12 serum serbest medya Biz kültür nöral progenitör hücrelerin suptemel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA), Sonic kirpi (Sus), nörotrofik faktör 3 (NT-3), N-2 ve triiyodotironin (T3) ile yürütülecek. Kültürlü hücreler yaklaşık her yedi günde 75cm matara başına 2.5e6 hücrelerini pasajlanmağa edilmektedir. Bu koşullar kullanılarak, kültürdeki hücrelerin çoğunluğunun az süreçleri ve bu gibi A2B5 ve O-4 gibi ön-oligodendrosit hücreleri, açık belirteçleri ile karakterize edilen bir morfoloji korumak. Biz dört büyüme faktörleri (GF) (bFGF, PDGF-AA, Şşş, NT-3) çıkarın ve PDN şartlandırılmış ortam eklerken, hücreler gibi GalC ve myelin oligodendrosit farklılaşma belirli daha süreçleri ve ekspres belirteçler, elde başlar bazik protein (MBP). Biz oligodendrosit eşsiz belirteçler tanımlamak amacıyla renkli akım sitometri kullanılarak fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.
Protocol
Not: öncül ve nöral oligodendrocytic soy hücreleri rutin kültürü için inkübasyon 37 ° C'de nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosfer içinde gerçekleştirilir. Her 2 gün, kültür ortamı% 40-70 oranında konfluent ise taze aracı madde içinde 50 ila% 100 kullanılarak değiştirilir. Yakınlarındaki confluency sırasında, kültürler genellikle bir haftalık çalışma programı üzerinde 2-2.5e6/T75 şişeyi de geçişli edilmektedir.
1. Kaplı Flask hazırlanması
- Kaplanmış şişeler daha sonra deiyonize su (DI-su) ile ceket T75 şişeleri, 100 ml poli-D-lizin (PDL) ve 5 mg seyreltik hazırlamak için, 50 mg / karanlık içinde oda sıcaklığında (RT) PDL ml. 1 ½ saat sonra, PDL aspire ve DI-su ile bir kez durulama şişeler. Hücrelerine bağlanır (Tablo 1) tohumlu önce kuru şişeler izin verin.
2. Progenitör türetilmiş Oligodentrositler (PDO) içine Sinir progenitör hücreleri farklanma Başlangıç
Için protokolİnsan MSS progenitör hücrelerin Olate önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. İnsan MSS progenitör hücrelerin NIH kurallara uygun olarak elde edilen bir 8 haftalık gebe fetal beynin telencephalon izole edilmiştir.
- 25 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) (Şekil 1A) ile takviye neurobasal ortamda PDL kaplanmış şişeler üzerinde sinir projenitör hücrelerin multipotential nüfus büyütün. Geçişi 11 (p11) daha yüksek ise bunları kullanmayın.
- Kültür yaklaşık% 70 birleşik olduğunda nöral progenitör hücrelerin ayırt başlayın.
- Sığır serum albumin, L-glutamin, gentamisin, N2 bileşenleri, T3, Şşş, NT-3, bFGF ve PDGF-AA (Tablo 1) ile desteklenmiş serumsuz DMEM / HAMS F12 01:01 orta kullanarak tam farklılaşma oligodendrosit orta Yap . Bu ortam, büyüme faktörleri (oligo orta + GF) ile oligo ortamı olarak tanımlanır.
- Progen kaldırşişelerinden alınmış itor ortamı ile bir kez durulama hücreler fosfat-tamponlu salin (PBS) ile, daha sonra oligo orta eklemek + GF oligodendrosit farklılaşma başlatmak için (2.3 anlatılan ayrıntılar). Oligodendrocytic soy taahhüt Sadece hücrelerinin (Şekil 1B) artacak. 3 hafta için bu ortam içinde kültür hücreleri.
- Her hafta, hücreler% 90-95 izdiham, geçit onları tripsin (% 0.05)-EDTA (% 0.1) (a T75 şişesi için 4 ml) kullanarak olduğunda. 50 ml'lik bir konik tüpe pasajlanmağa devam edilmesi için hücrelerin tüm orta aktarma; bu şartlı ortam tripsin gidermek için kullanılır. Hücrelerin kurumasına değil emin olun. Sonra tripsin ekleyin.
- Nazikçe hücre ayırma yardımcı olmak için şişeye birkaç kez dokunarak, oda sıcaklığında 5 dakika için hücreler tripsin ile inkübe edin.
- Müstakil hücreleri ile şişeye şartlı ortam 4-5 ml ilave edilerek tripsin dindir.
- Aynı 50 ml konik bir tüp için orta ve hücre transfer edin. 1.200 rpm (~ azından orta ve hücreler santrifüje300 xg) RT az 5 dakika.
- Süpernatan aspire tüpü yavaşça devrilmesi, hücre pelet tekrar süspansiyon ve daha sonra taze ortam oligo + GF ekleyin. Yavaşça pipet orta ve hücreler yukarı ve aşağı bir üniforma hücre süspansiyonu yapmak.
- Her bir yeni PDL-kaplı T75 şişeye hücreleri, ve transfer 2.5e6 sayın.
3. Oligodentrositler Arasındaki Farklılığın Nihai Adım
- Oligo orta + GF, hücrelerin% 70-80 izdiham olan kültür 3 hafta sonra, farklılaşma son işlem (Şekil 1C) başlatın.
- Oligo orta + GF olduğu gibi aynı şekilde, ama dört GF ilave edilmeden orta hazırlayın: Shh, NT-3, bFGF ve PDGF-AA. GF - dört GF olmadan Bu orta oligo ortamı olarak tanımlanır.
- Şişesi oligo orta + GF aspire, bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra ortam 16 ml toplam hacim eklemek, oligo aracı olan ¾ (12 ml) - GF ve ¼ (4 ml) bir PDN şartlı ortam olduğu için, 6-10 Gün). PDN şartlandırılmış ortam kullanılması da farklılaşma için ya da hücrelerin hayatta kalması için kritik değildir. Biz aslında ko-kültür deneyleri PDN hücreleri ile PDO yalnızca doğrudan temas PDO hayatta kalma süresine bir etkisinin olmadığı görülmüştür. Oligo orta sağkalım süresi - PDO hücreleri PDN hücreleri ile birlikte kültüre eğer GF iki veya üç hafta uzatılabilir olabilir. PDN içine insan nöral progenitör hücrelerin ayırt etmek için protokolü önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. Çoklu süreçleri (Şekil 1D) ile hücrelerin giderek farklılaşmış kültür kültür ortamı sonuçları Büyüme faktörü çekilmesi.
4. Akış Sitometri Assay
Flow sitometri testi kendi ebeveyn nüfusun olanlarla ilişki içinde farklılaşma sürecinde oligodendrosit belirteçlerin edinimi karşılaştırır.
- Nöral pro kullanınkontrol olarak genitörleridir. Oligo orta + GF poli-D-lizin ile kaplı iki T75 şişeler 2.5x10 6 hücrelerini Tohum PDO hücreleri.
- GF - Diğer matara oligo orta varken Bir hafta sonra, hücre canlılığı için bir kontrol kültürü olarak matara taze oligo orta + GF ile orta değiştirin.
- Hem medya PDO hücreleri ayırmak için 20 U / papain ml tripsin kullanılması uygun değildir. Papain hücre morfolojisini koruyan ayrışma sırasında hücreler üzerinde yumuşak bir etkiye sahip olmasıdır.
- Papain bir şişeye Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 5 ml ilave edilir. 10 dakika için ya da papain tamamen çözündürüldü ve çözelti berrak görünene kadar, 37 ° C 'de şişe yerleştirin. Bu hücreler ayrıştırmak için kullanılan papain çözümdür.
- Bir deoksiribonükleaz I (Dnase) şişenin (Tablo 1) ile EBSS 0.5 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın. Çözünmüş papain şişeye bu çözeltinin 0.25 ml ilave edilir. Bu karışım yaklaşık olarak 20 U / ml, papain ve 0 olan bir nihai konsantrasyonda içerir.005% DNaz.
- 15-30 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe hücreleri ve üzerinde yer papain çözelti (yukarıda açıklandığı gibi), bir mikroskop kullanılarak hücrelerin ayrılması izler. Ile ya da 7 dakika boyunca 1,200 rpm'de santrifüj ile GF olmadan ortam 5 ml reaksiyon durdurun.
- İki farklı 5 ml polipropilen tüplere içine de şişelerinden alınmış hücre peletleri aktarın ve normal fizyolojik ortam (UÖM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glukoz) ile yıkayınız 1 mg / ml ile takviye sığır serum albümin (YKY + BSA).
- Yüzey 4'te immün gerçekleştirme ° GalC (Tablo 2), A2B5, O4 için spesifik ve uygun bir şekilde titre birincil antikor kullanılarak 20 dakika için C'dir.
- 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta NPM + BSA ile yıkayın hücrelerini ve 20 dakika (tablo 2) için 4 ° C sıcaklıkta belirli sekonder antikor ile inkübe edilir.
- Nestin, glial fibriler asidik protein (GFAP), sınıf III ve olmaya da dahil intraselüler antijenlere leke içinta,-tubulin, ve miyelin bazik protein (MBP) (Tablo 2), oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid (PFA) hücreleri düzeltmek ve -20 ° C 'de 15 dakika süreyle soğuk% 70 etanol ile geçirgen
- 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve spesifik sekonder antikor (Tablo 2) ile inkübe edin.
- Flow sitometri analizi sırasında sağlam hücre ve hücre içi moloz arasında ayrımcılık için, 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihidroklorür (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY) ile hücreler leke.
- Yukarıdaki protokol optimize, biz her immunoreagent özgünlüğünü doğrulamak için tüm uygun kontrol deneyleri yapılmaktadır. Kısaca, direkt olarak etiketlenen antikorlar için, uygun negatif kontrol birincil antikor (örneğin, izotip kontrol) ile aynı izotip immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) ile florokrom konjugat bir direkt olarak konjuge antikor idi. Primer antikor indirekt immün, uygun negatif kontrol w içinözellikle birincil antikor oluşturulduğu ana immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) hedeflenen ki ilgi florokrom ile konjuge sekonder antikor olarak. Birden çok konaklardan (fare, tavşan, tavuk) primer antikorları birlikte kullanıldığı zaman, genellikle en aza indirmek için çapraz diğer bilgisayarlardan gelen immünoglobulinler karşı çapraz adsorblanmıştır kullanılan her ana ve her sekonder antikor primer antikor hedefleyen ikincil antikor kullanılır immunreaktivitesi barındırabilir. Pozitif kontroller bu antijenlere spesifik primer antikorlar ile doğrudan veya dolaylı immunoreactions kullanarak ilgi antijenleri ifade bilinen hücre hazırlıkları doğrudan veya dolaylı immün dahildir. Yukarıdaki optimizasyon yöntemleri immüno-deney her türü için bir kez yapılmıştır. Kontrol immunoreactions birincil ve ikincil antikorlar arasında anlamlı çapraz epitopu immünreaktivitesi saptandı. Flow sitometri düzgün yapıldı488 nm, 647 nm ayarlı uyarma dalgaboyu sağlayan üç lazer ile donatılmış bir FACVantage SE hücre sıralayıcı (BD Biosciences, San Jose, CA), ve geniş bir UV (351-364 nm) (Şekil 2) kullanılarak askıya floresan etiketli hücreleri .
5. İmmünofloresan Assay
Not: immünofloresan denemeleri için PDO oligo orta + GF veya oligo orta kaplanıyor - PDL ile kaplı 6 kuyucuğu içinde 2.5e5 de GF. Hücre büyüme faktörlerinin çekilmesinden sonra çeşitli zaman noktalarında% 2 PFA ile tespit edilir. Leke antikor Plastik 6 kuyucuğu yerine cam lameller üzerine yapılır.
- Ortamı çıkarın ve% 2 PFA ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. PFA atın. PBS, 5 dakika süre ile her hücreler 3 kez yıka. Hücrelerin kurumasına için dikkatli olun.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.25 triton çözeltisi kullanılarak hücre içi belirteçler için hücreler geçirgenliği.
- Spesifik olmayan bağlanma, blok hücreleri önlemek için, fya da HHG (1 mM, HEPES tamponu,% 2 at serumu, ve Hanks 'dengelenmiş tuz çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) ile 10 dak. HHG içinde önceden belirlenmiş bir yoğunlaşma ile spesifik primer antikorlar (Tablo 2) seyreltilir. Hücreleri üzerine sulandırılmış antikor yerleştirin. Karıştırma cihazı üzerinde, ya da 4 ° C'da gece boyunca oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka. HHG içinde önceden belirlenmiş bir konsantrasyon ile bir florokrom ile birlikte uygun bir ikincil antikor (Tablo 2) seyreltilir. Hücreler üzerine seyreltilmiş sekonder antikor karışımı yerleştirin. Karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde RT inkübe 1 saat.
- 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka.
- Photobleaching önlemek için hücrelere DAPI ile Altın Prolong ve bunların üstüne bir cam lamel yerleştirin 10 ul ekleyin. Bir Axiovert 200M floresans mikroskobu (Zeiss, Thornwood, NY) (Şekil 3) kullanılarak etiketli hücreler gözünüzde canlandırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu 70% -80% konfluent nöral progenitör hücre kültürü (Şekil 1A) gelen farklılaşma sürecini başlatmak için çok önemlidir. Birçok hücreler spesifik büyüme faktörleri içeren yana progenitör gelen oligo orta kültür ortamı değiştirdikten sonra ölecek. Bu oligodendrocytic fenotipi vermeyenleri nöral progenitör hücrelerin büyüme yeni orta (Şekil 1B) tarafından desteklenen olmayacağını belirtir. Bir hafta boyunca oligo orta + GF Kuluçka dar bir, iki kutuplu morfoloji (Şekil 1B) sergileyen bir ara kültür ile sonuçlanmıştır. Hücreler oligo orta + 3-4 hafta (Şekil 1C) için GF tutulur. Kültür ortamından Büyüme faktörü çekilme sayıda süreç (Şekil 1B) ile devamlı olarak farklılaşmış hücrelerin kültür ile sonuçlanmıştır. Akış sitometrisi veri kantitatif gösterimi için kullanılır.
Şekil 2A, 2Sadece küçük alt nüfuslar gibi astrosit işaretleyici GFAP (Şekil 2A), nöronal marker sınıf III β-tubulin (Şekil 2B) olarak soy kısıtlayıcı işaretleri ifade ise B ve 2C, nöral soylarının çoğunluğu nöroepitelyal kök hücre belirteci nestin ifade ettiğini göstermesi veya oligodendrosit işaretleyici O4 (Şekil 2C). Kültür ortamı oligo orta + GF ile değiştirildi ve hücrelerin 1 hafta boyunca kültüre edildiğinde, nestin ekspresyonunda azalma ve A2B5 ifade (Şekil 2B) görülebilir artmıştır. A2B5 bir neuroglial habercisi belirteçtir. Buna karşılık, 2 hafta orta değiştirilmesinden sonra, nestin ifadesi daha da azaldı ve yalnız A2B5 ifadesi de başka bir oligodendrosit işaretleyici, O4 (Şekil 2F) ifadesi olarak (Şekil 2E) artmıştır. İki gün sonra büyüme faktörü çekilme, O4 ifadesi, hem de GalC ifade artmışGeç oligodendrosit işaretleyici (Şekil 2G). Altı gün sonrası büyüme faktörü çekilmesi, O4 ve GalC ve co-ekspresyonu artmıştır (Şekil 2H) ve GalC ve MBP (Şekil 2I) ve co-ifadesi ile karşılaştırılabilir. Çok daha fazla epitop immün kültür içinde hücreleri yarısından daha MBP (Şekil 2J) eksprese olduğunu ortaya koymaktadır. PDO farklılaşma bir başka kanıt, büyüme faktörü çekilmesi (Şekil 3A-C) sonra, bu hücreler içinde MBP ifade geçici artış, bir immünofloresan testi kullanılarak, karakterize edilmiştir. Özetle, insan fetal nöral progenitör hücrelerin 3 büyük beyin hücre tipleri (Şekil 4) içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak in vitro prolifere edebiliyoruz.
Şekil 1. Faz kontrast mikroskobu of progenitör ortamında kültüre (A) nöral progenitör hücreleri; (B) bir hafta oligo orta + GF yetiştirilen nöral progenitör hücrelerin değişmiş bir dar, bipolar morfolojisi gösteren; (C) farklılaştırılmış progenitör türetilmiş oligodendrosit oligo ortamda 3 gün için yetiştirilen büyüme faktörü çekilmesi sergi oligodendrosit morfolojisi sonra birden süreçleri ile karakterizedir. 20x büyütme.
Şekil 2, sinir projenitör hücrelerinin akış sitometrik analizi ile birlikte eksprese eden öncü hücre işaretleyici Nestin (tüm dikey eksen):. (A) astrositik işaretleyici GFAP (B) nöronal işaretleyici β III tübülin ve (C) oligodendrocytic işaretleyici O4; (D) nöral progenitör hücrelerin oligo medyada bir hafta boyunca yetiştirilen + GF co-express Nestin ve A2B5; (E) nestin ve A2B5 ortak ifadesi oligo orta + GF (F) A2B5 ve O4 oligo orta + GF nöral ataları büyümenin iki hafta sonra co-ifade nöral ataları büyümenin iki hafta sonra, (G) iki büyüme faktörü çekilmesi gün sonra, farklılaşma farklı oligodendrosit belirteçleri, O4 ve GalC, ifade edilmiştir. GalC ve MPB (I) double-pozitif;; büyüme faktörü çekilmesinden sonra altı gün (H) hücrelerin artmış oranda O4 ve GalC için çift-pozitif ve O4 ve MBP için (J) çift pozitif. AJ dört bağımsız deneyler temsilcisi vardır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. Dolaylı immunofluorMBP (A), 2 gün (B) 5 gün, ve (C, D) 9 gün büyüme faktörü çekilmesinden sonra için projenitör-türevi oligodendrosit çeşitli teda boyama. (D) oligo ortam içinde 9 gün kültür aşamasında görüntü temsil eder - GF ve (E) aynı görüntünün beyaz kutusunun bir genişleme (A, B) 20x büyütme, (C, D) 32x büyütme..
Şekil 4. Bizim hücre kültürü modeli şematik gösterimi. Onların plastisite korurken İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential nöral progenitör hücrelerin in vitro prolifere. Farklı kültür koşulları kullanılarak, nöral progenitör hücreler nöronlar (PDN), astrositler (PDA) ve oligodendrosit farklılaşabilmektedir (PDO), gibi özel gösterilen diferansiyeiyon işaretleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, birincil insan nöral progenitör hücrelerin fetal oligodendrosit türetmek ve flow sitometri ve immünfloresan boyama kullanarak hem kendi fenotip karakterize açıklamaktadır. Fetal CNS sinir progenitörlerinin genişleme ve büyüme çok iyi 1-4 tarif edilmiştir. Erişkin insan beyaz madde 5-13 glial öncüleri tanımlamak ve ayırmak mümkün olsa bile Ancak, in vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit elde, zor kalır. Oligodendrosit 14-21 üreten miyelin içine fetal nöral progenitörlerinin doğrudan farklılaşma çeşitli kültür şartlarının gelişimi farklı girişimleri olmuştur. Bu protokol seçin büyüme faktörleri (PDGF-AA, bFGF, Şşş, ve NT-3), t ile desteklenen bir serumsuz ortamda 3 hafta büyüdüğü zaman O4 işaretleyici (Şekil 2) ifade nestin pozitif nöral progenitör hücrelerin daha açıklarşapka oligodendrosit öncüleri 22-24 çoğalmasını ve hayatta kalmak için gereklidir. O4 + hücrelerde büyüme faktörlerinin kaldırılmasını miyelin bileşenleri (galactocerebroside ve MB) ileri farklılaşması ve ifadesi ile sonuçlanmıştır. Buna ek olarak, oligodendrosit farklılaşma markırlerinin birinci iyi gelişmiş süreçleri (Şekil 1C) ile çok kutuplu hale hücrelere dar ve bipolar (Şekil 1B) ortaya çıktığını hücrelerinden morfolojik değişiklikler çakışır. Ayrıca farklılaşma son aşamalar izin vermek için, büyüme faktörlerinin kaldırma fare ve insan 15,25 her ikisi de yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Biz dört büyüme faktörlerinin ortadan kaldırılması farklılaşma nihai markırlerinin için gerekli olduğu görülmektedir iken triiyodotironin (T3) varlığı oligodendrosit 26 hayatta kalma ve farklılaşma için önemlidir. Hücreler oligo orta + GF tutulması ile bu karşılaştırıldığında birsa kontrolü.
Bu tür Shh ve bFGF 24 gibi sinyallerine yanıt olarak oligodendrosit hücreleri multipotent sinir progenitor hücrelerin farklılaşması tanımlamak için birinci değildir. Önceki raporlar kortikal oligodendrogenesis gebelik yaşı 22 ile orantılı artan myelinate insan fetal oligodendrosit kapasiteli insanlarda 24 10 haftalık gestasyonel yaş civarında başlar gösterdi. Galactocerebroside Farklılaşma + ve O4 + nöral progenitör hücrelerden oligodendrosit prekürsör hücrelerinin ikinci trimesterde fetal beyin 21,27 kullanarak rapor edilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin astrosit ve nöronlar dahil olmak üzere destek hücrelerinin yokluğunda çoğalırlar yoktur, ve kültür 21 saat boyunca hızlı bir şekilde kaybolur. Sistemimiz GalC oluşumu 8 hafta gebelik yaşı insan fetal kültürden + ve MBP + hücreleri destekler. Ayrıca biz açıklanan differenöronlar ile eş ekimi farklılaştırılmış oligodendrosit yaşam uzatmak olabilir ancak ntiated oligodendrosit, astrositler ve nöronlar gibi hücrelerin destek gerek kalmadan in vitro kültür olabilir. Bu protokolün Başka bir avantaj da fenotip korurken hafta için yetiştirilir ve kültür içinde pasajlanmağa devam edilebilir O4 + işaretleyici salgılayan hücrelerin bir çok sayıda yetiştirmek için imkanı vardır. O anda, bu O4 + hücreleri, büyüme faktörleri, ortam çıkarılır farklılaşma son adımda ileri sürülebilir. Bu yazıda belirtilen protokol vitro deneyler için uygun oligodendrosit soy ihtiyacını giderir. Ayrıca, biz progenitör türetilmiş oligodendrosit doğru nöral progenitörlerinin farklılaşma çağlayan neden özgü faktörlerin belirlenmesi gelişimsel hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli olduğuna inanıyoruzgeçişler. Aynı zamanda JCV gibi insan nörotropik virüslerin patogenezi ile ilgili demiyelinizan hastalıkları ve virüs-konak hücre etkileşimleri incelemek için önemli bir araç olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NINDS de İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar düzenleme ile yardım için mikroskop ve Pamela C. Eleme ile yardım için Moleküler Tıp ve Nörobilim, Rick Dreyfuss ve Laboratuvar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
