Metoden beskrevet her utnytter direkte injeksjon av entomopathogenic bakterier i hemocoel av<em> Manduca sexta</em> Insektlarver.<em> M. sexta</em> Er en kommersielt tilgjengelig, og godt studert insekt. Dermed representerer denne metoden en enkel tilnærming til å analysere host-bakterielle interaksjoner fra perspektivet til en eller begge parter.
Manduca sexta, kjent som tobakk hornworm, regnes som en betydelig landbruket pest, fôring på solanaceous planter inkludert tobakk og tomat. Mottakelighet M. sexta larver til en rekke entomopathogenic bakteriearter 1-5, samt mengde informasjon tilgjengelig om insekt immunforsvar 6-8, og den ventende genomsekvens 9 gjør det til en god modell organisme for bruk i å studere vert-mikrobe interaksjoner under patogenesen. I tillegg, M. sexta larver er relativt store og lett å manipulere og vedlikeholde i laboratoriet i forhold til andre mottakelige insektarter. Sin store størrelse forenkler også effektiv vev / hemolymph ekstraksjon for analyse av verten respons til infeksjon.
Metoden som presenteres her beskriver direkte injeksjon av bakterier inn i hemocoel (blod hulrom) av M. sexta larver. Denne tilnærmingenkan brukes til å analysere og sammenligne virulens egenskapene til ulike bakteriearter, stammer, eller mutanter ved å overvåke tid til insekt død etter injeksjon. Denne metoden ble utviklet for å studere patogenitet av Xenorhabdus og Photorhabdus arter, som vanligvis forbinder med nematode vektorer som et middel for å få innpass i insekt. Entomopathogenic nematoder typisk infisere larver via naturlige fordøyelsesenzymer eller respiratoriske åpninger, og slipper sin symbiotiske bakterier innholdet i insekt hemolymph (blod) kort tid etterpå 10. Injeksjonen metoden beskrevet her omgår behovet for en nematode vektor, dermed frakobling virkningene av bakterier og nematode på insekt. Denne metoden tillater for nøyaktig telling av smittefarlig materiale (celler eller protein) innenfor inokulatet, som ikke er mulig ved hjelp av andre eksisterende metoder for å analysere entomopathogenesis, herunder sammenpressing 11 og oral toksisitet analysene 12 <em>. Også oral giftighet analyser adressere virulens skilles giftstoffer introdusert i fordøyelsessystemet av larver, mens den direkte injeksjon metode løser virulens av hel-celle inokula.
Nytten av den direkte injeksjon metoden som er beskrevet her, er å analysere bakteriell patogenesen ved å overvåke insekt dødelighet. Imidlertid kan denne metoden enkelt utvides for anvendelse i å studere effekten av infeksjon på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer smitte via både humorale og cellulære responser. Humoral respons omfatter anerkjennelse av bakteriell-assosierte mønstre og påfølgende produksjon av ulike antimikrobielle peptider 7; uttrykket av gener som koder for disse peptidene kan overvåkes etter at direkte smitte via RNA ekstraksjon og kvantitativ PCR 13. Den cellulære responsen til infeksjon innebærer nodulation, innkapsling og fagocytose av smittestoffer ved hemocytes 6 </sup>. Å analysere disse responser, kan injiseres insekter bli dissekert og visualisert ved mikroskopi 13, 14.
Den direkte injeksjon av M. sexta larver med entomopathogenic bakterier, som beskrevet her, fungerer som en enkel og effektiv måte å analysere bakteriell virulens. Fremgangsmåten er også svært tilpasningsdyktig for å dekke ulike eksperimentelle fag og / eller tilstander. Bakterier kan være forberedt på ulike måter før injeksjon. I tilfelle av X. nematophila, villtype celler dyrket i næringsrikt Luria-Bertani (LB) medium til midten log fase er vanligvis den mest virulente og drepte de fleste …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation stipend IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA fellesskap FAI084441Z.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |