Summary
Metoden beskrevet her utnytter direkte injeksjon av entomopathogenic bakterier i hemocoel av
Abstract
Manduca sexta, kjent som tobakk hornworm, regnes som en betydelig landbruket pest, fôring på solanaceous planter inkludert tobakk og tomat. Mottakelighet M. sexta larver til en rekke entomopathogenic bakteriearter 1-5, samt mengde informasjon tilgjengelig om insekt immunforsvar 6-8, og den ventende genomsekvens 9 gjør det til en god modell organisme for bruk i å studere vert-mikrobe interaksjoner under patogenesen. I tillegg, M. sexta larver er relativt store og lett å manipulere og vedlikeholde i laboratoriet i forhold til andre mottakelige insektarter. Sin store størrelse forenkler også effektiv vev / hemolymph ekstraksjon for analyse av verten respons til infeksjon.
Metoden som presenteres her beskriver direkte injeksjon av bakterier inn i hemocoel (blod hulrom) av M. sexta larver. Denne tilnærmingenkan brukes til å analysere og sammenligne virulens egenskapene til ulike bakteriearter, stammer, eller mutanter ved å overvåke tid til insekt død etter injeksjon. Denne metoden ble utviklet for å studere patogenitet av Xenorhabdus og Photorhabdus arter, som vanligvis forbinder med nematode vektorer som et middel for å få innpass i insekt. Entomopathogenic nematoder typisk infisere larver via naturlige fordøyelsesenzymer eller respiratoriske åpninger, og slipper sin symbiotiske bakterier innholdet i insekt hemolymph (blod) kort tid etterpå 10. Injeksjonen metoden beskrevet her omgår behovet for en nematode vektor, dermed frakobling virkningene av bakterier og nematode på insekt. Denne metoden tillater for nøyaktig telling av smittefarlig materiale (celler eller protein) innenfor inokulatet, som ikke er mulig ved hjelp av andre eksisterende metoder for å analysere entomopathogenesis, herunder sammenpressing 11 og oral toksisitet analysene 12 Nytten av den direkte injeksjon metoden som er beskrevet her, er å analysere bakteriell patogenesen ved å overvåke insekt dødelighet. Imidlertid kan denne metoden enkelt utvides for anvendelse i å studere effekten av infeksjon på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer smitte via både humorale og cellulære responser. Humoral respons omfatter anerkjennelse av bakteriell-assosierte mønstre og påfølgende produksjon av ulike antimikrobielle peptider 7; uttrykket av gener som koder for disse peptidene kan overvåkes etter at direkte smitte via RNA ekstraksjon og kvantitativ PCR 13. Den cellulære responsen til infeksjon innebærer nodulation, innkapsling og fagocytose av smittestoffer ved hemocytes 6 13, 14.
Protocol
1. Insekt Egg Sterilisering og Rearing
- Forbered kosthold ved første autoklavering 15 g av den vedlagte agar i 900-1,000 ml H 2 O. Umiddelbart etter autoklavering, bland med 166 g hvetekim kosthold og bland godt i et laboratorium blender. Hell over i en tallerken (eller retter) for å kjøle, og deretter overføre kosthold til aluminiumsfolie, pakk tett, og oppbevar ved 4 ° C.
- Ved ankomst, sterilisere M. sexta egg med 250 ml 0,6% blekemiddel i 2-3 min i et glass filterholderen og Termosflaske apparat med en 90 mm filterpapir, røring.
- Slå på vakuum for å drenere blekemiddel og vask egg 3-4 ganger med 250 ml sterilt destillert H 2 O per vask.
- Overføre egg til frisk 90 mm filter papir plasseres i en Petri plate lokk og la dem tørke inntil de ikke lenger holde sammen (ca. 20-30 minutter).
- Overfør egg til bunnen av plastbeholdere med insekt kosthold, plassere ca 40 egg i hver beholder(Figur 1A). Egg er separert fra kosten å hindre fukt-indusert soppforurensning. Opprettholde egg på 26 ° C med en 16 timers lys: 8 timers mørke daglengde. Egg vil lysne til en gul-hvit farge før klekking.
- Når klekking er fullført, nøye overføre ca 25 larver hver til nye containere med diett på bunnen (figur 1B). Det er viktig å plukke opp hver larve av den lange sorte horn med pinsett for å unngå å skade dem under sine skjøre tidlige utviklingsstadier. Inkuber i 2 dager som ovenfor. Mens larve død er uvanlig på dette stadiet, kan noen døde eller, mer sannsynlig, utviklingshemmede forkrøplet larver observeres. Slike insekter bør utelukkes fra videre studier og avlivet ved frysing.
- For å unngå kannibalistiske atferd, overføring larver til individuelle beholdere med små biter av mat (figur 1C) og inkuber som ovenfor. Overvåke insekt utvikling, erstatte mat og renhold avføring out av containere annenhver dag inntil de gjennomgår den tredje larve molt (vanligvis 6-9 dager etter klekking). Dette er den 4. instar larvestadiet, preget av utseendet av svarte kroklignende crochets på hver proleg og økt prominence av striper langs insekt kroppen (figur 1D). Larvene kan variere betydelig i størrelse, men vanligvis veie 0,15 til 0,4 g ved å skrive inn 4. instar scenen. Larver av tilsvarende størrelse bør velges for injeksjon.
2. Utarbeidelse av bakterier for Injection
- Vokse bakteriestammen (e) som skal testes i henhold til standard prosedyrer til vekstfasen du ønsker å teste.
- Pellet 500 ul av hver bakteriestamme skal testes ved å spinne i 2 min i en mikrosentrifuge ved 13.000 rpm ved romtemperatur.
- Resuspender celler i 1 ml steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og pellet igjen som ovenfor.
- Resuspender celler i 0,5 ml sterilt PBS og 1x meaat optisk tetthet (OD) av suspensjonen. Fortynn alle suspensjoner til samme OD, om nødvendig. Sterile vekstmedier kan også brukes for celle resuspensjon og fortynning i stedet for 1x PBS, hvis ønskelig.
3. Injeksjon av 4. Instar Larver
- Forbered serielle 10-fold fortynninger av første bakteriestammen i 6 brønner i en 96-brønns mikrotiterplate i sterilt 1x PBS, ved hjelp av en frisk pipettespiss for hver fortynning (figur 2A). Sluttvolumet cellesuspensjon i hver brønn bør overstige volumet nødvendig for injeksjon (10 ul pr insekt) pluss 20 ul til plate inokulatet (se trinn 3,2 og 3,7).
- Spot 10 ul hver for 5 fortynninger (10 -2 gjennom 10 -6) langs toppen av en petriskål som inneholder et passende vekstmedium. Vippe platen slik at flekkene spredt til sentrum (figur 2B).
- Fjern insekt kosthold og avføring og sted insekter i beholdere på is forca 5 min.
- Steriliser sprøytespissen ved å skylle 3 ganger hver i to rør 70-100% etanol, etterfulgt av ett rør av steril H 2 O (Figur 2C). Volumet av væske må være tilstrekkelig til å senke nålen.
- Kvantifisere fortynnede cellesuspensjoner under et mikroskop ved hjelp av en hemocytometer. Avhengig av ønsket inokulum, tegner 10 ul fra den riktige mikrotiter brønnen (figur 2D).
- Vattpinne insektvoks overflaten med 95% etanol, og injiser 10 ml cellesuspensjon i insekt i en vinkel (mindre enn 45 °) bak en av abdominal prolegs. Pass på å ikke punktere tarmen og injisere innholdet like under epidermal lag (figur 2E). Mens noen tap av hemolymph (klar, grønn-blå væske) er normal, svevestøv og gul væske som kommer ut av injeksjonsstedet er tegn på gut punktering. Hvis dette skjer, ofre insekt og få en ny larve å replassere den.
- Gjenta trinn 3,6 for hver gjenværende insekt i den første injeksjonen gruppen. Nålen sterilisering er ikke nødvendig mellom hvert insekt injisert med den samme fortynning og stamme av bakterier hvis forurensning oppstår. Alternativt kan en gjentatt dispenser benyttes til større konsistens i injeksjonsvolum blant prøver.
- Etter injisering hvert insekt med første stamme av bakterier, gjenta trinn 3,2, denne gangen spotting cellesuspensjoner i midten av platen og la dem flyte mot bunnen (figur 2F). Inkuber skålene ved passende temperatur og telle koloniene å nummerere inokulat. Denne andre Plating trinn brukes til å verifisere at prøvene ikke ble forurenset under injeksjonen prosessen, da dette ville resultere i uensartede colony tall mellom de første og andre metallovertrekket.
- Gjenta trinn 3,1 gjennom 3,8 for hver stamme av bakterier i forsøket. Til slutt injiserer 3-5 insekter med sterilt 1x PBS ved hjelp av en sterile nålen som negativ kontrollgruppe. Inkuber insekter ved 26 ° C med en 16 timers lys: 8 timers mørke fotoperiode.
- Overvåke insektvoks overlevelse over tid etter injeksjon. Insekt død er karakterisert som en mangel på frivillig bevegelse ved stimulering. Insekter viser ofte tap av appetitt, diaré (vannaktig, gul ekskrementer), og / eller vanntap ("svette") under infeksjonen før døden, disse egenskapene kan være verdt å merke seg i tillegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt eksempel på et insekt dødelighet assay er vist i figur 3. I dette eksperimentet, ble insekter injisert med ca 50 koloni dannende enheter (CFU) av enten villtype (ATCC19061) eller en svekket mutant stamme (LRP 13) av Xenorhabdus nematophila dyrket til midt-log fase (n = 6 pr insekter stamme). Insekter ble observert i ca 72 timer, og prosent av injisert insekter lever ved hver endepunktet registrert. I dette tilfellet, utstilt attenuated belastningen en klar forsinkelse i insekt dreping; villtype stamme drept alle 6 larver innen 30 hr etter injeksjon, før død enhver mutant-infisert larve.
Figur 1. Insect oppdrett i forberedelse til injeksjon. A) ca 40 overflate-sterilisert eggene plassert på bunnen av en 5 oz kopp medsterile insekt kosthold hviler på en gummipropp. B) Tyve nyklekkede insekter overføres til 5 oz kopper med sterilt insektvoks diett på bunnen og inkubert i 2 dager. C) Insekter er neste overført individuelt til 1oz kopper med steril kosthold på bunnen og inkubert før de modnes. D) Fjerde stadium M. sexta larver med fremtredende striper langs kroppen (øverst) og svarte crochets på mage prolegs (nederst).
Figur 2. Injeksjon av 4. instar M. sexta larver. A) Bakterier er serielt fortynnet i en 96-brønns plate. B) Ti mikroliter flere fortynninger er belagt å nummerere inokulat. C) Sprøyten steriliseres med 3 skyllinger i etanol (2x) og sterilt vann. D) Ti mikroliter fra passende fortynning trekkes inn i sprøyten. E) Cellesuspensjonen injiseres i 45 °vinkel bak den første abdominal proleg. F) Fortynninger igjen belagt for å gi en andre mål på inokulum.
Figur 3. Representant resultat av M. sexta injeksjon analysen. Omtrent 50 koloni-dannende enheter (CFU) av Xenorhabdus nematophila celler i stasjonær fase (10 pl fra den 10 -4 fortynning) ble injisert inn i seks 4 th instar M. sexta larver per belastning. Både vill type og en mutant stamme (LRP) med en etablert virulens defekten ble injisert og insektene overvåket for dødelighet over tid. Resultatene rapporteres som prosent gjenlevende insekter over tid (i timer). Disse kurvene er statistisk forskjellige, med en p-verdi på 0.000458 via log-rank analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den direkte injeksjon av M. sexta larver med entomopathogenic bakterier, som beskrevet her, fungerer som en enkel og effektiv måte å analysere bakteriell virulens. Fremgangsmåten er også svært tilpasningsdyktig for å dekke ulike eksperimentelle fag og / eller tilstander. Bakterier kan være forberedt på ulike måter før injeksjon. I tilfelle av X. nematophila, villtype celler dyrket i næringsrikt Luria-Bertani (LB) medium til midten log fase er vanligvis den mest virulente og drepte de fleste eller alle insekter i løpet av 30 timer etter at injeksjon. Celler i stasjonær fase ofte ta 5-10 timer lengre tid å drepe larvene. Skjønt vekstfase påvirker virulens, vises det totale antall celler injisert for å være mindre viktig 16 med typisk inokula fra 20 til 20.000 CFU. Faktisk, i tilfelle av Xenorhabdus og Photorhabdus arter, så få som 5 CFU er tilstrekkelig til å drepe insektet verten 17. For å kunne vurdere virulens properties av bakterielle arter som er resistente mot etanol sterilisering (f.eks Bacillus arter), kan engangsnåler brukes til å injisere hver unike stamme i stedet for etanol sterilisering (trinn 3.4).
Ytterligere justeringer til denne metoden kan medføre endringer i oppdrett og / eller manipulasjon av M. sexta. For eksempel kan insekter bli oppdratt på tomat eller tobakk blader som en mer naturlig matkilde. Alternativt ulike utviklingsstadier av M. sexta larver kan undersøkes ved denne metode. Fjerde instar larver ble valgt basert på deres relativt stor størrelse, men mindre larver kan også injiseres ved denne metode. Femte stadium larver kan injiseres, men endringene i immunsystemet i denne fasen av utviklingen gjengi sent 5. instar larver mer utsatt enn tidlig 5. instar larver 18, potensielt kompliserende dataanalyse.
Til slutt, den direkte injeksjonmetode kan tilpasses for bruk med andre insektarter. M. sexta brukes som en modell for vert høypatogen arter fordi det er mindre utsatt for smitte enn andre (mer mottakelige) modell organismer, slik som Galleria mellonella. G. mellonella kan injiseres ved metoden beskrevet i dette arbeidet 19, imidlertid, og kan være nyttig for å bestemme bakteriearter mindre virulente enn Xenorhabdus og Photorhabdus arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation stipend IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA fellesskap FAI084441Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
