Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Resumen

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele de Manduca sexta Larvas de insectos. M. sexta Es un insecto disponibles comercialmente y bien estudiado. Por lo tanto, este método representa un método simple para analizar bacterianas interacción huésped-desde la perspectiva de uno o ambos socios.

Resumen

Manduca sexta, comúnmente conocido como el gusano del tabaco, se considera una plaga agrícola importante, se alimentan de plantas solanáceas, incluyendo tabaco y tomate. La susceptibilidad de M. larvas sexta a una variedad de especies bacterianas entomopatógenos ^1-5, así como la gran cantidad de información disponible sobre el sistema inmunológico del insecto ^6-8, y la secuencia del genoma pendiente ⁹ lo convierten en un organismo modelo bueno para el uso en el estudio de la interacción huésped-microbio durante la patogénesis. Además, M. sexta larvas son relativamente grandes y fáciles de manipular y mantener en el laboratorio en relación a otras especies de insectos susceptibles. Su gran tamaño también facilita eficiente tejido / hemolinfa de extracción para el análisis de la respuesta del huésped a la infección.

El método aquí presentado describe la inyección directa de bacterias en el hemocele (cavidad sangre) de M. sexta larvas. Este enfoquese puede utilizar para analizar y comparar las características de virulencia de diversas especies bacterianas, cepas o mutantes simplemente monitorizar el tiempo a la muerte del insecto después de la inyección. Este método fue desarrollado para estudiar la patogenicidad de Xenorhabdus y Photorhabdus especies, que suelen asociar con vectores de nematodos como un medio para ganar la entrada en el insecto. Nematodos entomopatógenos típicamente infectan larvas vía digestiva natural o aberturas respiratorias, y liberan su contenido de bacterias simbióticas en la hemolinfa del insecto (sangre) poco después ^10. El método de inyección aquí descrito evita la necesidad de un vector de nematodos, así desacoplar los efectos de las bacterias y nematodos en el insecto. Este método permite la enumeración precisa de material infeccioso (células o proteínas) en el inóculo, que no es posible con otros métodos existentes para el análisis de entomopathogenesis, incluyendo formación de muescas ¹¹ y los ensayos de toxicidad por vía oral ¹² La utilidad del método de inyección directa como se describe aquí es analizar la patogénesis bacteriana mediante la supervisión de mortalidad de los insectos. Sin embargo, este método puede ser fácilmente ampliado para su uso en el estudio de los efectos de la infección en el M. sexta sistema inmune. El insecto responde a la infección a través de ambas respuestas humoral y celular. La respuesta humoral se incluye el reconocimiento de bacterias asociadas con los patrones y la subsiguiente producción de diversos péptidos antimicrobianos ^7, la expresión de genes que codifican estos péptidos pueden ser monitoreados posterior a la infección directa a través de la extracción de RNA y PCR cuantitativa ^13. La respuesta celular a la infección implica la nodulación, encapsulación, y la fagocitosis de agentes infecciosos por hemocitos ⁶ 13, 14.

Protocolo

1. Esterilización de Insectos huevo y Cría

1. Preparar dieta por primera autoclave 15 g de agar proporcionado en la 900-1,000 ml H ₂ O. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, se mezclan con 166 g de germen de trigo dieta y mezcla bien en un mezclador de laboratorio. Vierta en un plato (o platos) para enfriar y transferir dieta para papel de aluminio, envolver herméticamente, y se almacena a 4 ° C.
2. A su llegada, esterilizar M. Sexta huevos con 250 ml de solución de lejía al 0,6% durante 2-3 min en un soporte de filtro de vidrio y aparatos termo con un papel de filtro de 90 mm, revolviendo de vez en cuando.
....

Resultados

Un ejemplo representativo de un ensayo de mortalidad de los insectos se representa en la Figura 3. En este experimento, los insectos fueron inyectados con aproximadamente 50 unidades formadoras de colonias (UFC) de tipo salvaje (ATCC19061) o un mutante de la cepa atenuada (lrp ¹³⁾ de Xenorhabdus nematophila crecer hasta la fase logarítmica media (n = 6 insectos por cepa). Los insectos fueron observados durante aproximadamente 72 horas, y registró el porcentaje de insectos in.......

Discusión

La inyección directa de M. larvas sexta con bacterias entomopatógenos, como se describe aquí, sirve como un medio sencillo y eficaz para analizar la virulencia bacteriana. El método es también muy adaptable para adaptarse a diferentes sujetos experimentales y / o condiciones. Las bacterias se pueden preparar de diversas maneras antes de la inyección. En el caso de X. nematophila, las células de tipo salvaje cultivadas en rica en nutrientes Luria-Bertani (LB) a mitad de la fase log son típicame.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
90 mm papel de filtro	Whatman	1001 090
Filtro de vidrio titular	Millipore	XX1004700
Manduca sexta huevos	Carolina Biological Supply	143880
Dieta Gypsy Moth agar +	MP Biomedicals	0296029301
5,5 oz envases de plástico y tapas	Solo Cup Company	URC55-0090-0090 PI4
1 oz envases de plástico y tapas	Dart Container Corporation	100PC 100PCL25
1x PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4
Jeringa	Hamilton	80208	Calibre 30, 0,375 "de largo, estilo, punto 2