Summary
위상 시프트 nanoemulsions (PSNE)는 지역화 된 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하기 위해 높은 강도 집중 초음파를 사용하여 기화 할 수 있습니다. 이 보고서에서는 좁은 크기 분포와 안정 PSNE의 준비가 설명되어 있습니다. 또한, 초음파로 인한 박리에 기화의 PSNE의 영향은 조직 - 모방의 유령에서 증명된다.
Abstract
높은 강도 집중 초음파 (HIFU)는 열 종양 어블 레이션하기 위해 임상 적으로 사용됩니다. 현지화 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하려면 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울은 HIFU에 의해 기화 할 수있는 개발되었습니다. 많은 종양의 vasculature는 인해 빠른 성장을 비정상적으로 새는 있으며, 나노 입자는 fenestrations을 관통하고 수동적으로 종양 내에 축적 할 수 있습니다. 따라서 방울의 크기를 조절하는 종양에서 더 축적 될 수 있습니다. 이 보고서에서는 좁은 크기 분포와 위상 편이 nanoemulsion (PSNE)에서 안정 방울의 준비가 설명되어 있습니다. PSNE는 액체 perfluorocarbon의 존재에 지질 솔루션을 sonicating에 의해 합성되었다. 좁은 크기 분포는 100 또는 200 nm의 기공 크기의 필터를 사용하여 PSNE을 여러 번 압출하여 얻은 것입니다. 크기 분포는 동적 광 산란을 사용하여 7 일 동안 측정되었습니다. PolyacPSNE을 포함 rylamide의 hydrogels은 체외 실험에서 준비되었다. hydrogels의 PSNE 방울은 초음파와 지역화 난방 개선 결과 거품과 기화되었습니다. 기화 PSNE 더 빠른 난방이 가능하며 열 절제에 필요한 초음파 강도를 줄일 수 있습니다. 따라서, PSNE는 잠재적으로 HIFU로 인한 열 절제 트리트먼트 치료 결과를 개선, 종양의 열 절제를 강화 할 예정이다.
Protocol
1. 단계 - 교대 Nanoemulsion의 준비 (PSNE)
- 11 MG DPPC와 클로로포름의 1.68 MG DSPE-PEG2000를 해산
- 유리 둥근 바닥 플라스크에 드라이 지질 필름을 형성하기 위해 유기 용매를 증발
- 밤 지질 필름을 Dessicate
- 인산 버퍼 생리 (PBS)의 5.5 ML과 지질 필름을 Rehydrate
- 45 ° C의 물을 욕조에 열 솔루션은 지질이 영화는 정기적으로 vortexing, 해체 할 때까지
- 7 ML의 유리 병에 지질 솔루션을 전송
- 20 % 진폭에서 2 분에 대한 지질 솔루션을 Sonicate
- 2.5 ML의 두 병에 솔루션을 나눈다 각 (나머지 0.5 ML를 삭제)
- 각 유리 병에 2.5 ML PBS를 추가합니다
- 0 ° C 얼음물에 각 병을 놓고
- 각 유리 병의 50 μl DDFP을 추가
- 25 % 진폭, 펄스 모드 (50 초에서 10 초), 시간에 60 초 총 : 다음 설정을 사용하여 얼음물에서 각 병을 Sonicate
- TR20 ML의 섬광 병에 ansfer PSNE 솔루션
- 10 ML 최종 볼륨의 결과로, 각 유리 병에 5 ML PBS를 추가합니다
- 제조업체에서 제공 압출기 다음과 같은 지시를 조립
- 탈 이온수 각 부분을 씻어
- 필터 지원 기지의 중심에 스테인레스 스틸 지원 디스크를 놓으십시오
- 스테인레스 스틸 지원 디스크 상단에있는 스테인리스 스틸 메쉬를 배치
- 핀셋 사용하여 스테인레스 스틸 메쉬에 압출기 배출 디스크 막 (반짝이는 사이드까지)를 배치
- 핀셋 사용하여 배수 디스크 막에 압출기 필터 (반짝이는 사이드까지)를 배치
- 조심스럽게 필터의 작은 O-링을 배치하고 지원 기지 위의 thermobarrel와 압출기의 상단에 배치
- 부분적으로 첫번째 각 날개 너트를 조여 다음, 완전히 번갈아 방식으로 손으로 날개 너트를 조여
- 에 압출기를 연결질소 가스 라인
- 상단 샘플 포트에 압출기, 피펫 10 ML 탈 이온수를 프라임하려면 시작을 한도 및 배기 밸브를 조여
- 천천히 멤브레인을 통해 샘플을 강제로 압력을 높이기 위해 질소 가스 라인을 열고 출구 튜브에서 샘플을 수집
- 사용 후, 반대 순서로 분해 탈 이온수와 압출기 부품을 헹구고, 멤브레인 필터와 멤브레인 배수 디스크를 삭제
- 200 nm의 필터를 통해 10 배를 압출의 100 나노 미터 방울 만, 사전 조건 PSNE
- 필터 100 나노 미터 또는 200 nm의를 통해 돌출 PSNE은 16 배 좁은 크기 분포를 얻을 수
2. PSNE를 포함 Polyacrylamide의 히드로 겔의 작성
- 5 ML 탈 이온수에 1.2 g BSA 가루를 diluting하여 24% BSA 솔루션을 준비
- 한 ML deionized wate에 희석 0.1 g APS 분말로 10 %의 APS 솔루션을 준비연구
- 다음과 같은 순서로, 2.1 ML의 아크릴 아미드 솔루션, 1.2 ML 트리스 버퍼, 0.1 ML 10 % APS, 4.5 ML 24% BSA 솔루션, 플라스틱 챔버에 3.6 ML 탈 이온수를 섞어
- 40 열 ° 1 시간에 진공 C 및 장소
- PSNE 480 μl를 추가하고 철저하게 부드럽게 플라스틱 챔버를 회전하여 섞는다.
- 12 μl TEMED를 추가하고 2 시간에 12 ° C 물 목욕에있는 챔버를 배치
3. 대표 결과
조직 - 모방의 히드로 겔 유령과 초음파 실험에 대한 설정의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 이 프로토콜은 적어도 일주일 솔루션 안정 좁은 크기 분포와 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울에 결과를 표시합니다. 동적 광 분산 (90Plus 입자 크기 분석기, 브룩 헤이븐 계기, Holtsville, NY)로 측정 크기 분포는 PSNE는 압출 100와 200를 사용하기 위해 그림 2에 표시됩니다나노 필터. 동적 광 산란을 사용하여 측정 시간의 경과에 PSNE 유효 직경은, PSNE 적어도 일주일 안정적임을 입증 표 1에 표시됩니다. polyacrylamide의 히드로 겔의 기화 전후 PSNE의 B-모드 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 또한, 병변은 알부민과 PSNE는 그림 4에 표시됩니다를 포함하는 polyacrylamide의 히드로 겔에 HIFU로 인한 난방의 15 초에 의해 형성. 병변의 비대칭 모양 초음파 경로에 거품 구름의 존재로 인해 발생 prefocal 난방의 결과입니다. 이 전송 음향 전력을 줄임으로써 최소화 할 수 prefocal 난방 시설, 거품의 분산으로 인한 병변 형성에 유의하는 것이 중요합니다.
그림 1. 조직 - 밈과 초음파 실험에 대한 실험 설정의 개략도hydrogels을 icking.
그림 2. 크기 100 나노 미터 또는 200 nm의 필터를 통해 압출 PSNE의 배포는 동적 광 분산을 사용하여 측정. 종좌표 축의 단위는 샘플의 총 분산 된 광 강도에 비해 특정 크기의 입자의 분산 된 빛의 강도에 따라 결정됩니다.
그림 3. B-모드 이미지 polyacrylamide의 히드로 겔의 PSNE 기화 (A) 이전 및 (b) 후. 화살표가 거품 구름이 PSNE 기화에 의해 형성 된 초점 영역을 나타냅니다.
polyacr의 그림 4. 이미지알부민과 PSNE 포함 ylamide의 히드로 겔는 (a) HIFU로 기화와 sonication 전에하고, (b) 후 초음파 유도 가열의 결과로 병변 형성을 보여줍니다. 초음파 중심 주파수 3.3 MHz의했다. 초음파 신호가 초기 30주기로 구성, 6.4 W 펄스가 PSNE을 날려 버리기 위해, 즉시 W.은 0.77에서 지속적인 초음파의 15 초 다음
| 압출 후 일 | 200 nm의 필터 압출 | 100 nm의 필터 압출 | ||
| 디아 의미합니다. (NM) | 표준. 개발자. (NM) | 디아 의미합니다. (NM) | 표준. 개발자. (NM) | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <TD> 177.72.5 | 124.8 | 3.1 | |
표 1. 100 nm의 200 nm의 필터를 사용 압출 차례로 7 일의 직경과 PSNE의 표준 편차를 의미합니다.
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Discussion
높은 강도 집중 초음파 (HIFU)이 열 종양 어블 레이션하기 위해 임상 적으로 사용됩니다. 1 지역화 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하려면 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울은 HIFU에 의해 기화 할 수있는 개발되었습니다. 많은 종양의 vasculature는 인해 빠른 성장을 비정상적으로 새는 것입니다. 따라서 2 나노 입자는 fenestrations을 관통하고 수동적으로 종양 내에 축적 할 수 있으며, 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과로 알려진 과정입니다. 3이 표시되었습니다 그 70와 200 나노 미터 사이의 나노 입자는 종양에서 가장 효율적으로 축적.이 보고서에 설명 된 4 절차는 좁은 크기 분포와 지질 코팅 perfluorocarbon 방울의 안정적인 위상 편이 nanoemulsion (PSNE)를 생산하고 있습니다. 과거에는 polydisperse 크기 PSNE의 분포하지만, 최근의 연구를 사용하여 대부분의 연구는 좁은 크기 분포와 PSNE을 생산에 초점을 맞추고 있습니다.5, 6이 프로토콜에 설명 된 압출 방법은 하나가 종양 내에 축적 될 체계적으로 관리 방울의 비율을 증가하기 위해 크기를 제어 할 수 있습니다.
nanodroplets의 dodecafluoropentane 핵심은 29 끓는 온도가 ° C. 7 따라서,이 PSNE 준비의 각 단계에서 낮은 온도를 유지하는 것이 중요합니다. Sonication은 솔루션의 온도를 증가하지만, 펄스 sonication 순서를 사용하고 sonication 동안 얼음물에 샘플을 배치하는 것은 증발을 줄일 수 있습니다. 지질 코팅 물방울이 형성되면, 끓는 온도는 ° C 표면 장력으로 인해 8. PSNE 기화는 온도와 압력에 따라 달라지게된다 또한 액체 perfluorocarbon 방울의 크기와 구성에 따라 달라집니다 60 위 증가합니다. 9 예를 들어, 그것은 3.8 MPA 위의 정상 rarefactional 압력이 200 기화하는 데 필요한 것을 발견했습니다37 번 나노 미터 DDFP 방울은 ° C. 10 코팅 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)과 복합 지질로 작은 물방울 따라서 여러 일 동안 PSNE의 크기 안정성을 증가 융합을 억제한다. 또한,이 PEG는 언어 malignancies에 축적 체계적으로 관리 PSNE의 분율이 증가 할 수 지질 기반 소포, 11-13의 순환 시간을 증가시킬 수있는 문서화되었습니다. 14, 15
perfluorocarbon의 방울은 체외 열 절제 연구에 대한 알부민을 포함하는 조직 - 모방의 polyacrylamide의 히드로 겔 점선으로 중단 할 수 있습니다. 16 PSNE -로드 hydrogels는 기화 기준을 평가뿐만 아니라 거품이 강화 된 HIFU로 인한 난방의 병변 형성을 공부에 유용합니다 . hydrogels은 흡수 변환 음향 에너지를 열로, 한 번 히드로 겔의 온도는 히드로 겔 denatures에 알부민 58 ° C를 초과하고 불투명이된다hydrogels은 광학적으로 투명합니다. 17 때문에 실시간으로 단백질 변성을 관찰 할 수 있습니다. hydrogels 내 PSNE의 기화는 초음파로 인한 난방의 효율을 높이기 위해 사용되는 거품을 만듭니다. 집중 변환기, PSNE 기화 및 기포 강화 난방을 사용하는 것은 따라서 생물학적 미디어 (예 : 조직) 개입에 원치 않는 난방을 피하고, 지역화 할 수 있습니다. 유령에서 기화 거품 구름이 초음파 빔 전파에 영향을 미치는 prefocal 난방을 일으킬 수, 음향 전력 임계 값을 초과하는가 제공됩니다. 이 임계 값 아래 흩어져있는 전력은 prefocal 지역에서 조직을 어블 레이션이 너무 낮아, 결과적으로, ablated 볼륨이 거품 구름의 위치에 국한되어 있습니다. 생체의 지역화 된 난방을 향상시키는 PSNE의 사용은 잠재적으로 HIFU 종양 절제 치료의 결과를 향상시킬 수. 첫 번째 단계로, 압출 기반의 프로토콜은 제어하기 위해 개발되었습니다아슬 아슬하게 배포 PSNE의 크기. PSNE을 사용하여 광학적으로 투명 조직 - 모방의 hydrogels 내에 분산, 그것은 초음파로 인한 가열 및 열 절제에 기화의 PSNE의 영향을 조사 할 수 있습니다. 생체 내 종양 코어 치료 에이전트 및 나노 입자의 배송이 발견 증가 중간 압력으로 인해 도전 남아있다. 이 PSNE은 우선적으로 종양이 주변에서 모이게 쉽게 종양 핵심을 관통하지 않을 수 가능성이 높습니다. hydrogels의 연구 거품이 prefocal 지역에서 ablated 권의 결과로 변환기쪽으로 음향 에너지를 리디렉션 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 전송 음향 전원이 특정 임계 값을 초과하는 경우 이러한 현상이 발생합니다. 따라서, 그것은뿐만 아니라 높은 포웨에서 말초 여백에서 만든 거품에서 음향 에너지를 반사하여 내부 코어를 어블 레이션으로써해야 할 일이 하나 전원 설정을 사용하여 종양 주변에 거품이 강화 된 종양 절제를 현지화 할 수 있습니다R 설정입니다. 또한, 주변 건강한 조직을 손상 방지 종양 주변의 정확한 절제은 여전히 중요한 돌파구를 차지 잠재적으로 이전에 비 절제 종양은 수술로 제거 할 수 있도록 수 있습니다. 생체 조건과 조직 - 모방의 hydrogels의 차이가 있지만, 유령은 열 절제에 대한 초음파 매개 변수를 최적화하기 위해 PSNE와 초음파 강화 난방의 물리적 메커니즘을 이해하는 데 유용합니다. 다음은 실험실에서 병원으로 향상 초음파로 인한 박리에 대한 PSNE의 사용을 번역을위한 중요한 단계입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 BU / CIMIT 응용 의료 공학 Predoctoral 휄로 십, 공학 참여 연구 개시 기금 (BRIGE)를 확대 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 국립 보건원 (R21EB0094930)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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