Summary
Fasförskjutning nanoemulsioner (PSNE) kan förångas med hög intensitet fokuserat ultraljud för att förbättra lokal uppvärmning och förbättra termisk ablation i tumörer. I denna rapport beredningen av stabila PSNE med en smal storleksfördelning beskrivs. Dessutom är effekten av förångad PSNE på ultraljud-medierad ablation visats i vävnads-imitera spöken.
Abstract
Hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) används kliniskt för att termiskt avlägsna tumörer. För att förbättra lokal uppvärmning och förbättra termisk ablation i tumörer har lipid-belagda perfluorkol droppar utvecklats som kan förångas av HIFU. Vaskulaturen i många tumörer är onormalt läckande grund av deras snabba tillväxt och nanopartiklar kan penetrera fenestrationer och passivt ackumuleras i tumörer. Sålunda, kan styra storleken på dropparna resultera i bättre ackumulering i tumörer. I denna rapport framställning av stabila droppar i en fasförskjutning nanoemulsion (PSNE) med en smal storleksfördelning beskrivs. PSNE syntetiserades genom sonikering en lipidlösning i närvaro av flytande perfluorkarbon. En snäv storleksfördelning erhölls genom strängsprutning av PSNE flera gånger med filter med porstorlekar av 100 eller 200 nm. Storleksfördelningen mättes under en 7-dagarsperiod med dynamisk ljusspridning. Polyacrylamide hydrogeler innehållande PSNE var förberedda för in vitro-försök. PSNE droppar i hydrogeler förångas med ultraljud och de resulterande bubblorna förbättras lokal uppvärmning. Förångad PSNE möjliggör snabbare uppvärmning och minskar också ultraljud intensitet som behövs för termisk ablation. Således är PSNE förväntas öka termisk ablation i tumörer, eventuellt förbättra terapeutiska resultat av HIFU-medierade termiska ablation behandlingar.
Protocol
1. Beredning av fasförskjutning nanoemulsion (PSNE)
- Lös 11 mg DPPC och 1,68 mg DSPE-PEG2000 i kloroform
- Indunsta det organiska lösningsmedlet för att bilda en torr lipidfilm i ett glas rundkolv
- Dessicate lipidfilmen natten
- Rehydrera lipidfilmen med 5,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Värm lösningen i en 45 ° C vattenbad tills lipidfilm löses, vortexa periodiskt
- Överför lipidlösning i 7 ml flaska
- Sonikera lipidlösning under 2 min vid 20% amplitud
- Dela upp lösningen i två injektionsflaskor med 2,5 ml vardera (kassera återstående 0,5 ml)
- Tillsätt 2,5 ml PBS till varje flaska
- Placera varje injektionsflaska i en 0 ° C is-vattenbad
- Lägg 50 ul DDFP till varje flaska
- Sonikera varje injektionsflaska i is-vattenbad med följande inställningar: 25% amplitud, pulsad läge (10 sek på, 50 sek av), 60 sek totalt i tid
- Transfer PSNE lösningar till 20 ml scintillationsfläskor
- Tillsätt 5 ml PBS till varje flaska, vilket resulterar i 10 ml slutlig volym
- Montera extruder följande riktningar som tillhandahålls av tillverkaren
- Skölj varje del med avjoniserat vatten
- Placera rostfria skivan stål stöd i mitten av filtret stödbasen
- Placera nät av rostfritt stål ovanpå den rostfria stödskivan
- Med hjälp av en pincett, placera en extruder membran avlopp skiva (blanka sidan uppåt) på nät av rostfritt stål
- Med hjälp av en pincett, placera extrudern filter (blanka sidan uppåt) på avloppet skivan membranet
- Placera försiktigt den lilla O-ringen på filtret och placera thermobarrel och extrudern topp ovanför stödbasen
- Delvis åt varje vingmuttern först, sedan helt åt vinge-muttrarna för hand i ett växelvis
- Anslut extrudern tillen kvävgas linje
- För att förbereda extrudern, pipetten 10 ml avjoniserat vatten i den övre provöppningen, CAP öppningen och dra åt avluftningsventilen
- Öppna långsamt linjen kvävgas för att öka trycket, tvingar provet genom membranen, och samla upp provet från utloppsslangen
- Efter användning, ta isär i omvänd ordning, skölj strängsprutanordningen delar med avjoniserat vatten, och kasta membranfilter och membran avlopp skiva
- För 100 nm droppar endast förutsättning PSNE genom extrudering 10 gånger genom 200 nm filter
- Extrude PSNE 16 gånger genom 100 nm eller 200 nm filter för att få snäv storleksfördelning
2. Beredning av polyakrylamid hydrogel innehållande PSNE
- Bered 24% BSA-lösning genom utspädning av 1,2 g BSA pulver i 5 ml avjoniserat vatten
- Bered 10% APS lösning genom utspädning 0,1 g APS pulver i 1 ml avjoniserat water
- I följande ordning, blanda 2,1 ml av akrylamid, 1,2 ml Tris-buffert, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA-lösning, och 3,6 ml avjoniserat vatten i plastkammare
- Värm till 40 ° C och placerades under vakuum under 1 timme
- Lägg 480 ul PSNE och grundligt blanda genom att försiktigt snurra plast kammaren.
- Tillsätt 12 | il TEMED och placera kammaren i en 12 ° C vattenbad under 2 timmar
3. Representativa resultat
En schematisk av inställningarna för ultraljud experiment med vävnads-Efterlikna hydrogel fantomer visas i figur 1. Detta protokoll resulterar i lipid-belagda perfluorkol droppar med en snäv storleksfördelning som är stabila i lösning under åtminstone en vecka. Storleksfördelningen mätt med dynamisk ljusspridning (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) visas i figur 2 för PSNE extruderades med användning av 100 och 200nm filter. Den PSNE effektiv diameter över tid, mätt med dynamisk ljusspridning, anges i tabell 1, visar att PSNE är stabila i minst en vecka. B-mode bilder av PSNE före och efter förångning i en polyakrylamid hydrogel visas i figur 3. Dessutom, en lesion som bildas av 15 sekunder av HIFU-medierad uppvärmning i en polyakrylamid hydrogel innehållande albumin och PSNE visas i figur 4. Den asymmetriska formen av lesionen är ett resultat av prefocal uppvärmning som uppstår på grund av närvaron av bubblan molnet i ultraljud banan. Det är viktigt att notera att prefocal uppvärmning och lesionsbildning grund spridning från bubblor kan minimeras genom att minska den överförda akustiska effekten.
Figur 1. Skiss av experimentell inställning för ultraljud experiment med vävnads-MIMIcking hydrogeler.
Figur 2. Storleksfördelning av PSNE extruderas genom 100 nm eller 200 nm filter, mätt med dynamisk ljusspridning. Enheterna hos ordinatavärdena axlarna baserad på intensiteten av spritt ljus från partiklar av en viss storlek i förhållande till den totala spridda ljusintensiteten från provet.
Figur 3. B-mode bilder (a) före och (b) efter PSNE förångning i en polyakrylamid hydrogel. Pilen anger den fokala regionen där en bubbla moln bildades genom PSNE förångning.
Figur 4. Bilder av polyacrylamid hydrogel innehållande albumin och PSNE (a) före och (b) efter förångning och sonikering med HIFU, visar lesionsbildning som ett resultat av ultraljud-inducerad uppvärmning. Ultraljud mittfrekvens var 3,3 MHz. Den ultraljudssignal bestod av en initial 30-cykel, 6,4 W puls för att förånga PSNE, omedelbart följt av 15 sekunder av kontinuerlig ultraljud vid 0,77 W.
| Dagar efter extrudering | Extruderad med 200 nm filter | Extruderad med 100 nm filter | ||
| Mean Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Mean Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tabell 1. Medeldiameter och standardavvikelsen för PSNE vid en och sju dagar efter extrudering med 100 nm och 200 nm filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) används kliniskt för att termiskt avlägsna tumörer. För att förbättra lokal uppvärmning och förbättra termisk ablation i tumörer 1 har lipid-belagda perfluorkol droppar utvecklats som kan förångas av HIFU. Vaskulaturen i många tumörer är onormalt läckande grund av deras snabba tillväxt. 2 Sålunda nanopartiklar kan penetrera fenestrationer och passivt ackumuleras i tumörer, en process känd som den förbättrade permeabiliteten och retention (EPR) effekt. 3 Det har visat sig att nanopartiklar mellan 70 och 200 nm ackumuleras mest effektivt i tumörer. 4 Det förfarande som beskrivs i denna rapport ger en stabil fasförskjutning nanoemulsion (PSNE) i lipid-belagda perfluorkol droppar med en snäv storleksfördelning. I det förflutna har de flesta studier använt polydispersa storlek distributioner av PSNE, men nyare studier fokuserat på att ta fram PSNE med smala storleksfördelningar.5, 6 Den strängsprutning som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att kontrollera storleken för att öka andelen droppar administrerade systemiskt som ackumuleras i tumörer.
Den dodekafluorpentan kärna nanodroplets har en kokpunkt av 29 ° C. 7 Därför är det viktigt att bibehålla en låg temperatur under varje steg av PSNE preparatet. Sonikering ökar temperaturen av lösningen, men med användning av en pulsad sonikering sekvens och placera provet i ett is-vattenbad under sonikering kan minska avdunstningen. När lipid-belagda dropparna har bildats, ökar den kokande temperatur över 60 ° C på grund av ytspänning. 8 PSNE förångning är temperatur-och tryck-beroende och beror också på storleken och sammansättningen av de flytande perfluorkarbon dropparna. 9 till exempel fann man att peak rarefactional tryck över 3,8 MPa behövdes för att förånga 200nm DDFP droppar vid 37 ° C 10 Beläggning dropparna med lipider konjugerade med poly (etylenglykol) (PEG) inhiberar fusion, vilket ökar storleken stabiliteten hos PSNE under flera dagar. Dessutom har det dokumenterats att PEG kan öka cirkulationstiden för lipidbaserade vesiklar, 11-13 som kan öka fraktionen av systemiskt administrerad PSNE som ackumuleras i lokaliserade maligniteter. 14, 15
De perfluoriderat dropparna kan hängas i en vävnad-imitera polyakrylamid hydrogel Phantom innehållande albumin för in vitro termiska ablation studier. Användbara för att bedöma förångningen tröskelvärden samt studera lesionsbildning från bubble-förstärkt HIFU-medierad uppvärmning 16 De PSNE-laddade hydrogeler . Hydrogelerna absorberar och omvandlar akustisk energi till värme, och när temperaturen i hydrogelen överstiger 58 ° C, albumin i hydrogelpartiklarna denaturerar och blir ogenomskinlig. 17 Eftersom hydrogeler är optiskt transparent, är det möjligt att observera proteindenaturering i realtid. Förångning av PSNE inom hydrogelerna skapar bubblor, som används för att öka effektiviteten av ultraljud-medierad uppvärmning. Med hjälp av en fokuserad givare, PSNE förångning och bubbla-förstärkt uppvärmning kan lokaliseras på så sätt undvika oönskade uppvärmning i mellanliggande biologiska medier (dvs. vävnad). I fantomer, kan det förångade bubblan molnet påverkar spridningen ultraljudsstrålen och orsaka prefocal uppvärmning, förutsatt den akustiska effekten överstiger ett tröskelvärde. Under denna tröskel är den spridda effekten för låg för att avlägsna vävnad i prefocal regionen, följaktligen är den ablationsbehandlade volymen begränsad till platsen för bubblan molnet. Användningen av PSNE att förbättra lokal uppvärmning in vivo skulle kunna förbättra resultaten av HIFU tumör ablation behandlingar. Som ett första steg, har en strängsprutning-baserat protokoll har utvecklats för att kontrollerastorleken på snävt fördelade PSNE. Använda PSNE dispergerade i optiskt transparenta vävnad imitera hydrogeler, är det möjligt att undersöka effekten av förångad PSNE på ultraljud-medierad värme och termisk ablation. Leverans av terapeutiska medel och nanopartiklar till tumören kärnan in vivo är fortfarande en utmaning på grund av ökade interstitiella tryck som finns där. Det är troligt att PSNE preferentiellt skulle ackumuleras i tumören periferin och kan inte lätt penetrera tumören kärnan. Studier i hydrogeler har visat att bubblor kan omdirigera akustisk energi mot givaren resulterar i avlägsnad volymer i prefocal regionen. Detta fenomen inträffar när den överförda akustiska effekten överskrider en viss gräns. Således är det möjligt att lokalisera bubbla-förstärkt tumör ablation till tumören periferin med hjälp av någon effektinställning samt avlägsna den inre kärnan genom att reflektera akustisk energi från bubblor skapas i distala marginal vid en högre poweR Inställning. Dessutom skulle precis ablation av tumören periferin som undviker att skada omgivande frisk vävnad utgör fortfarande en betydande genombrott och skulle kunna utnyttja tidigare ej resekerbara tumörer tas bort kirurgiskt. Även om det finns skillnader mellan in vivo villkor och vävnads-imitera hydrogeler, de vålnader är användbara för att förstå de fysiska mekanismerna för ultraljud-förstärkt uppvärmning med PSNE för att optimera ultraljud parametrar för termisk ablation. Dessa är viktiga steg för att översätta användningen av PSNE för att öka ultraljud-medierad ablation från laboratoriet till kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en BU / CIMIT Tillämpad Healthcare Engineering Predoctoral Fellowship, en National Science Foundation bredda deltagandet Forskning Inledande bidrag i teknisk (brige) och National Institutes of Health (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F.
- Baban, D. F., Seymour, L. W.
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
