Summary
Faz kaydırmalı nanoemulsions (PSNE) lokalize ısıtma geliştirmenize ve tümörlerde termal ablasyon geliştirmek için yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason kullanarak buharlaşmış olabilir. Bu yazıda, dar bir boyut dağılımı ile kararlı PSNE hazırlanması tarif edilmektedir. Ayrıca, ultrason aracılı ablasyonu konusunda buharlaşmış PSNE etkisini doku taklidi hayaletleri gösterilmiştir.
Abstract
Yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (HIFU) termal tümörleri baskılamak için klinik olarak kullanılmaktadır. Lokal ısıtma artırmak ve tümörlerin termal ablasyon artırmak için, lipid-kaplı perfluorokarbonlar damlacıkları HIFU buharlaştınlabilen geliştirilmiştir. Birçok tümörün damar nedeniyle hızlı büyüme anormal sızdıran ve nanopartiküller fenestrasyonlar nüfuz ve pasif tümörler içinde birikir edebiliyoruz. Böylece, damlacıkların boyutunu denetlemek tümörler içinde daha iyi bir birikim neden olabilir. Bu yazıda, dar bir boyut dağılımı ile bir faz kayması nanoemulsion (PSNE) içinde kararlı damlacıklarının hazırlanması tarif edilmektedir. PSNE sıvı perfluorokarbon varlığında, bir lipid çözelti sonicating sentezlendi. Dar bir büyüklük dağılımı 100 veya 200 nm gözenek boyutlarına sahip filtreler kullanılarak PSNE birçok kez ekstrüzyon ile elde edilmiştir. Boyut dağılımı dinamik ışık saçılımı ile 7 günlük bir süre boyunca ölçüldü. PolyacPSNE içeren rylamide hidrojeller in vitro deneyler için hazırlanmıştır. Hidrojellerde PSNE damlacıkları ultrason ve lokalize ısıtma geliştirilmiş çıkan kabarcıkları ile buharlaştırılır edildi. Buharlaşan PSNE daha hızlı ısıtma sağlar ve ayrıca termal ablasyon için gerekli ultrason yoğunluğunu azaltır. Böylece, PSNE potansiyel HIFU-aracılı termal ablasyon tedavisi terapötik sonuçların iyileştirilmesi, tümörlerde termal ablasyon geliştirmek için bekleniyor.
Protocol
1. Faz kaydırmalı Nanoemulsion hazırlanması (PSNE)
- 11 mg DPPC ve kloroform içinde 1.68 mg DSPE-PEG2000 eritilir
- Bir cam yuvarlak tabanlı şişeye kuru bir lipid film oluşturmak için organik çözücü buharlaştırılır
- Gecede lipid filmi Dessicate
- Fosfat-tamponlu salin (PBS) ve 5.5 ml lipid filmi rehidrate
- 45 ° C su banyosunda Isı çözümü lipid filmi periyodik vorteks, eriyene kadar
- 7 ml flakon içine lipid çözümü aktarın
- % 20 genlik 2 dakika süreyle lipid çözelti sonikasyon
- 2.5 ml'lik iki şişe içine çözümü bölün, her (kalan 0.5 ml atmak)
- Her flakon 2.5 ml PBS ekleyin
- A 0 ° C'de buz-su banyosu içinde her şişeye yerleştirin
- Her bir şişeye 50 ul ekle DDFP
- % 25 genlik, pulsed (50 sn kapalı 10 sn), zaman 60 sn toplam: Aşağıdaki ayarları kullanarak buz-su banyosunda her flakon sonikasyon
- Tr20 ml sintilasyon şişeleri için ansfer PSNE çözümler
- 10 ml nihai hacim ile sonuçlanan, her şişeye 5 ml PBS ekleme
- Üretici tarafından sağlanan ekstruder aşağıdaki tarifi birleştirin
- Deiyonize su ile her bir kısım Durulama
- Filtre destek tabanının merkezinde, paslanmaz çelik destek diski yerleştirin
- Paslanmaz çelik destek diski üzerinde paslanmaz çelik elek yerleştirin
- Cımbız kullanarak, paslanmaz çelik hasır üzerine bir ekstrüder tahliye diski membran (parlak tarafı yukarı) yerleştirin
- Cımbız kullanarak, drenaj disk membran üzerindeki ekstruder filtresi (parlak tarafı yukarı) yerleştirin
- Dikkatlice filtre üzerinde küçük O-ring yerleştirin ve destek tabanı yukarıda thermobarrel ve ekstruder üst yerleştirin
- Kısmen olanlar her kanat somunu sıkın, sonra tamamen bir alternatif moda elle kanat somunlarını
- Için ekstrüder bağlanBir azot gazı hattı
- En iyi numune portu içine ekstruder, 10 ml deiyonize su hazırlamak için, açılış kap ve havalandırma valfı sıkıştırmak
- Yavaşça zarından örnek zorlayarak, basıncı artırmak için azot gazı hattı açın ve çıkış borudan numune
- Kullanımdan sonra, ters sırada sökülmesi deiyonize su ile ekstruder parçalar durulama ve bir membran filtre, membran boşaltma disk atmak
- 200 nm filtresi aracılığıyla 10 kez çekilerek 100 nm damlacıkları için sadece ön koşul PSNE
- Filtre 100 nm veya 200 nm ile Extrude PSNE 16 kez dar boyut dağılımı elde etmek için
2. PSNE İçeren Poliakrilamid Hidrojel hazırlanması
- 5 ml deiyonize su içinde 1.2 g BSA, toz seyreltilerek% 24 BSA çözeltisi hazırlayın
- 1 mL deiyonize Su sağlama içinde seyreltilmiş 0.1 g APS toz% 10 APS çözelti hazırlayınr
- Aşağıdaki sırada, 2.1 ml akrilamid çözeltisi, 1.2 ml Tris tamponu, 0.1 ml% 10 APS, 4,5 ml% 24 BSA çözeltisi ve plastik bölme içinde 3.6 ml deiyonize su karışımı
- 40 ° Isı, 1 saat boyunca vakum altına C ve yer
- PSNE 480 ul ekleyin ve iyice yavaşça plastik odasına dönen tarafından karıştırın.
- 12 ul TEMED ilave edin ve 2 saat için bir 12 ° C su banyosu içinde oda yerleştirmek
3. Temsilcisi Sonuçlar
Doku taklit eden hidrojel fantom ile ultrason deneyler için bir düzeneğin şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu protokol, en azından bir hafta için çözelti içinde kararlı olan dar bir boyut dağılımı ile kaplanmış perfluorokarbonlar lipid damlacıkları ile sonuçlanır. Dinamik ışık saçılımı (90Plus Parçacık Boyutu Analiz Cihazı, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) ile ölçülen büyüklük dağılımı PSNE ekstrüde 100 ve 200 kullanımı için, Şekil 2 'de gösterilmiştirnm filtreler. Dinamik ışık saçılımı kullanılarak ölçülen zamanla PSNE etkin çapı, PSNE en az bir hafta boyunca istikrarlı olduğunu gösteren Tablo 1'de listelenmiştir. Bir poliakrilamid hidrojel içinde buharlaştırma önce ve sonra PSNE B-mod görüntü Şekil 3 'de gösterilmiştir. Ayrıca, bir lezyon albümin ve PSNE Şekil 4 de gösterilmiştir içeren bir poliakrilamid hidrojel HIFU-aracılı ısıtma 15 saniye ile oluşmuştur. Lezyonun asimetrik şekli ultrason yol içinde kabarcık bulut varlığı nedeniyle oluşur prefocal ısıtma bir sonucudur. Bu iletilen akustik güç azaltarak minimize edilebilir prefocal ısıtma ve baloncuklar gelen dağılım nedeniyle lezyon oluşumu dikkat etmek önemlidir.
Şekil 1. Doku-mim ile ultrason deneyler için deney düzeneği şematik diyagramıhidrojeller Icking.
Şekil 2. Boyut 100 nm veya 200 nm filtreler aracılığıyla çekilmiş PSNE dağıtımı, dinamik ışık saçılımı kullanılarak ölçülür. Ordinat eksenlerinin birimleri numuneden toplam dağınık ışık yoğunluğuna göre belli bir boyuttaki parçacıklar gelen dağınık ışık yoğunluğunu dayanmaktadır.
Şekil 3,. B-mod görüntüleri bir poliakrilamid hidrojel PSNE buharlaşma (a) daha önce ve (b) sonra. Ok bir baloncuk bulut PSNE buharlaşma tarafından kuruldu fokal bir bölgenin gösterir.
Polyacr Şekil 4. Görüntüleralbümin ve PSNE içeren ilamit hidrojel (a) 'HIFU buharlaştırma ve sonikasyon önce ve (b) sonra, ultrason ile endüklenen ısıtma sonucu olarak lezyon oluşumu ortaya koydu. Ultrason merkez frekansı 3.3 MHz idi. Ultrason sinyali ilk 30 döngü oluşuyordu, 6.4 W darbe PSNE buharlaştırmak için hemen W. 0.77 sürekli ultrason 15 sn izledi
| Ekstrüzyon sonra gün | 200 nm filtreli Ekstrüde | 100 nm filtreli Ekstrüde | ||
| Dia ortalama. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Dia ortalama. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <td> 177.72.5 | 124.8 | 3.1 | |
Tablo 1. 100 nm ve 200 nm filtreler ile ekstrüzyon ardına ve yedi gün de çapı ve PSNE standart sapma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (HIFU) termal tümörleri baskılamak için klinik olarak kullanılmaktadır. 1 lokalize ısıtma geliştirmenize ve tümörlerde termal ablasyon artırmak için, lipid kaplı perflorokarbon damlacıkları HIFU buharlaştınlabilen geliştirilmiştir. Birçok tümörün damar nedeniyle hızlı büyüme anormal sızıntılı olduğunu. Böylece 2, nanopartiküller fenestrasyonlar nüfuz ve pasif tümörler içinde birikir edebiliyoruz, gelişmiş geçirgenlik ve saklama (EPR) etkisi olarak bilinen bir süreç. 3. Bu gösterilmiştir ki 70 ve 200 nm arasında nanopartiküller tümörlerde en verimli birikir. Bu raporda açıklanan 4 prosedürü dar boyut dağılımı ile lipid kaplı perflorokarbon damlacıkları istikrarlı bir faz kayması nanoemulsion (PSNE) üretir. Geçmişte, polidispers boyutu PSNE dağılımları, ancak son çalışmalarda kullanılan çalışmaların çoğu dar boyut dağılımına sahip PSNE üretmeye odaklanmıştır.5, 6 Bu protokolde tarif edilen ekstrüzyon yöntemi bir tümör içerisinde birikebilir sistemik olarak uygulanan damlacıkların yüzdesini arttırmak için boyutunu kontrol etmesini sağlar.
Nanodroplets ve dodecafluoropentane çekirdek 29 bir kaynama sıcaklığına sahiptir ° C. 7 Böylece, PSNE hazırlık her bir adımı sırasında düşük bir sıcaklıkta muhafaza etmek önemlidir. Sonikasyon çözeltinin sıcaklığını artırır, ama darbeli bir sonikasyon dizisi kullanılarak ve sonikasyon esnasında bir buz-su banyosu içinde örnek vermek buharlaşma azaltabilir. Lipid damlacıkları meydana kaplı sonra, kaynama sıcaklığı ° C yüzey geriliminden dolayı. 8 PSNE buharlaşma ısı ve basınç bağımlıdır ve aynı zamanda sıvı perfluorokarbon damlacıkların boyutunu ve yapısına bağlıdır 60 üzerine yükseltir. 9 Örneğin, Bu 3.8 MPa yukarıda zirve seyrekleştirme basıncı 200 buharlaştırmak için gerekli olduğu görülmüştür37 nm DDFP damlacıklar ° C. 10. Kaplama poli (etilen glikol) (PEG) ile konjuge lipid damlacıkları ile bu nedenle birden fazla gün içinde PSNE büyüklüğü kararlılığını arttırdığı, füzyon inhibe eder. Ayrıca, PEG lokalize malignitelerde birikir sistemik olarak uygulanan PSNE arasında fraksiyonu artırabilir lipid tabanlı vezikül, 11-13 dolaşım zamanı artırabilir dokümante edilmiştir. 14, 15
Perflorokarbon damlacıkları vitro termal ablasyon çalışmalar için albumin içeren bir doku taklidi poliakrilamid hidrojel fantom askıya alınabilir. 16. PSNE yüklü hidrojellerin buharlaşma eşikleri değerlendirilmesi yanı sıra kabarcık geliştirilmiş HIFU-aracılı ısıtma lezyon oluşumunu incelemek için yararlıdır . Hidrojeller emer ve dönüştürmek akustik enerjiyi ısı enerjisine ve bir kez hidrojel sıcaklık, hidrojel yıkılır albümin 58 ° C'yi ve opak olurHidrojellerin optik olarak transparan vardır. 17 için, gerçek zamanlı olarak protein denatürasyonunu izlemek mümkündür. Hidrojellerin içinde PSNE buharlaştırma ultrason aracılı ısıtma verimi artırmak için kullanılan kabarcıklar oluşturur. Odaklanmış bir dönüştürücü, PSNE buharlaşma ve kabarcık-geliştirilmiş ısıtma kullanma dolayısıyla biyolojik ortamı (doku) müdahalede istenmeyen ısıtma kaçınarak, lokalize olabilir. Hayaletleri olarak, buharlaşmış balonu bulut ultrason ışını yayılımı etkileyen ve prefocal ısıtma neden olabilir, akustik güç bir eşiği aştığında sağladı. Bu eşiğin altında, dağınık güç prefocal bölgedeki dokuyu kesebilme çok düşük, dolayısıyla kesilen ses kabarcık bulutun yere sınırlıdır. In vivo lokalize ısıtma geliştirmek için PSNE kullanımı potansiyel HIFU tümör ablasyonu tedavilerin sonuçları artırabilir. İlk adım olarak, bir ekstrüzyon-tabanlı bir protokol kontrol etmek için geliştirilmiştirDar yayılışlı PSNE boyutu. PSNE kullanarak optik olarak saydam doku taklidi hidrojeller içerisinde dağınık, o ultrason aracılı ısıtma ve termal ablasyon üzerine buharlaşmış PSNE etkisini araştırmak mümkündür. In vivo tümör çekirdek terapötik ajanlar ve nanopartiküller Teslim orada bulunduğu artmış interstisyel baskılar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu PSNE tercihen tümör çevre içinde birikir, ve kolayca tümör çekirdek nüfuz etme olasılığı vardır. Hidrojellerde Çalışmalar kabarcıklar prefocal bölgede kesilen debisi dönüştürücü doğru akustik enerji yönlendirebilirsiniz göstermiştir. Iletilen akustik güç belirli bir eşiği aştığında, bu durum oluşur. Böylece, aynı zamanda bir yüksek powe distal marjı oluşturulan kabarcıklar kapalı akustik enerjiyi yansıtmak suretiyle iç çekirdek baskılamak gibi bir güç ayarı kullanarak tümör çevresine kabarcık geliştirilmiş tümör ablasyonu lokalize etmek mümkündürr ayarı. Ayrıca, çevredeki sağlıklı dokuya zarar kaçınır tümör çevresi kesin ablasyonu hala önemli bir atılım temsil edecek ve potansiyel olarak daha önce non-rezektabl tümörleri ameliyatla izin verebilir. In vivo koşullar ve doku taklidi Hidrojellerde arasında farklılıklar olmasına rağmen, hayaletler termal ablasyon için ultrason parametrelerini optimize etmek amacıyla PSNE ile ultrasonografi geliştirilmiş ısıtma fiziksel mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Bu laboratuvardan kliniğe artırılması ultrason aracılı ablasyon PSNE kullanımı çevirenler için kritik adımlar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma bir BU / CIMIT Uygulamalı Sağlık Mühendisliği predoctoral Bursu, Mühendislik Katılımı Araştırma Başlatma Grant (Brige) genişleten bir Ulusal Bilim Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21EB0094930) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F.
- Baban, D. F., Seymour, L. W.
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
