ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.
Abstract
Motoneuron השדרה כבר זמן רב מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד עצבי כי זה תא עצב של מערכת העצבים המרכזית עם המאפיינים הייחודיים של (1) יש מטרות לזיהוי בקלות (את סיבי שריר) ויש לו פונקציה מאוד ידועה ולכן (כדי לשלוט בכיווץ שריר), (2) להיות היעד המתכנס של רשתות רבות בעמוד שדרה ויורדות, ומכאן שמו של "מסלול משותף סופי"; ו (3) שסומא גדול המאפשר לחדור אליהם עם אלקטרודות התאית החדה . יתר על כן, כאשר למדו בvivo, ניתן לרשום את הפעילות החשמלית של תאי עצב האחראים ולכח שפותח על ידי מטרותיהם שרירים בו זמנית. ביצוע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo לכן לשים experimentalist בעמדה הייחודית של להיות מסוגל ללמוד, באותו הזמן, את כל המדורים של "יחידת המנוע" (השם שניתן לmotoneuron, האקסון שלו, וסיבי השריר זה innervates 1): את התשומות שולטו בmotoneuron, את המאפיינים של אלקטרו motoneuron, ואת ההשפעה של מאפיינים אלה על התפקוד הפיזיולוגי של תאי עצב האחראים, כלומר את הכח הנוצר על ידי יחידת המנוע שלה. עם זאת, גישה זו היא מאוד מאתגרת בגלל ההכנה לא יכולה להיות משותקת ובכך היציבות המכאנית להקלטה התאית היא מופחתת. לכן, סוג זה של ניסויים הושג רק בחתולים ובעכברים. עם זאת, המחקר של מערכות מוטוריות בעמוד שדרה יכול לעשות קפיצה אדירה אם זה היה אפשרי לביצוע ניסויים דומים בעכברים נורמלים ומהונדס גנטיים.
מסיבות טכניות, המחקר של הרשתות בעמוד השדרה בעכברים יש בעיקר מוגבל לילוד בהכנות חוץ גופייה, שבו תאי עצב האחראים ורשתות השדרה הם לא בוגרים, על תאי עצב האחראים מופרדים מהמטרות שלהם, וכשלמד בפרוסות, מוtoneurons מופרדים ממרבית התשומות שלהם. עד לאחרונה, רק כמה קבוצות הצליחו לבצע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo 2-4, כולל צוות שלנו שפרסם הכנה חדשה שאפשרה לנו להשיג הקלטות יציבות מאוד של תאי עצב אחראים in vivo בעכברים בוגרים 5,6. עם זאת, הקלטות אלה התקבלו בבעלי חיים משותקים, כלומר ללא האפשרות להקליט את תפוקת הכח של תאי עצב האחראים האלה. כאן אנו מציגים הארכת הכנה מקורית זה, בו הצליח להשיג הקלטות בו זמניות של את המאפיינים אלקטרופזיולוגים של תאי עצב האחראים ושל הכח שפותח על ידי יחידת המנוע שלהם. מדובר בהישג חשוב, שכן היא מאפשרת לנו לזהות את הסוגים השונים של תאי עצב אחראים המבוססים על פרופיל כוחם, ובכך חושף את תפקידם. יחד עם מודלים גנטיים מפריעים מעגלים מגזריים שדרת 7-9, או reproducting disea האנושיse 10,11, אנו מצפים בטכניקה זו כדי להיות כלי חיוני למחקר של מערכת מוטורית בעמוד שדרה.
Protocol
1. צעד אחד
תרופות טרום הרדמה: 10-15 דקות לפני האינדוקציה של הרדמה, להזריק אטרופין (0.20 מ"ג / ק"ג) וmethylprenidsolone (0.05 מ"ג) תת cutaneously למנוע ריור ובצקת, בהתאמה.
2. שלב השני
אינדוקציה של הרדמה: להזריק נתרן פנטוברביטל (70 מ"ג / ק"ג) או תערובת של קטמין / xylazine (100 מ"ג / ק"ג ו 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה) התוך peritoneally. בואו העכבר ללכת תחת עד ניתן להשיג שום רפלקס קמצוץ בוהן. אם ההרדמה נראית בהירה מדי, להשלים עם 1/4 מהמנה.
3. שלב שלישי
* הערה: הניתוח הזה הוא הליך מסוף.
כאשר מטוס כירורגית של הרדמה הושג, להעביר את העכבר על שמיכה חמה גדלה בתנוחת שכיבה.
- כסה את פרצופו של העכבר עם מסכת האספקה O הטהור 2 בזרימה סביב 100 מ"ל / דקה.
- שבי גם hindlimb הנכון.
- תהפוך עכבר למצב שכיבה אבל דואגים להשאיר את מסכת החמצן במקום.
4. שלב רביעי
אבטח את העכבר במקום עם תפרים הניחו סביב האיברים ומאובטחים בארבע הפינות של משטח העבודה.
5. השלב החמישי
הכנס בדיקת טמפרטורה לניטור טמפרטורת ליבת העכבר. התאם חימום שמיכה / כוח מנורה כדי לשמור על טמפרטורת ליבה בין 36 ° C ו 38 ° C.
6. קנה נשימה והנשמה מלאכותית
- באמצעות מספריים קהים, לעשות חתך מעל קנה הנשימה ולמשוך את העור בשני הצדדים.
- שימוש במלקחיים בוטים, לקרוע לגזרים את בלוטות הרוק, כדי לחשוף את שני שרירים דקים (Sternohyoid) המכסים את קנה נשימה.
- שימוש במלקחיים בוטים, להפריד בין שתיים muscles יחד ההפרדה המדיאלי שלהם כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- שימוש של 7 מלקחי דומון, להחליק 2 אורך תפר משי 4.0 מתחת לקנה הנשימה.
- לעשות חתך רוחבי בקנה הנשימה שבבין שתי טבעות סחוס אך היזהר שלא לסעיף קנה הנשימה לחלוטין.
- הכנס את הצינור לקנה הנשימה קנה נשימה יורד, ואז לאבטח אותו משני צדי פתח הכניסה על ידי קשירת התפרים מעליה. קנה נשימת הצינור מחובר למכונת נשמת עכבר (SAR-830/AP, CWE Inc) וcapnograph (μcapstar, CWE Inc). המאוורר מחובר דרך שקית עמידה, למקור הטהור O 2. התאם את הפרמטרים של ההנשמה (100-150 פעימות לדקת קצב נשימה, 170-310 μl נפח סוף הגאות) כך שהעכבר לא נלחם נגד המערכות להנשמה המלאכותיות וPCO סוף גאות 2 הוא יציב בין% 4 ו 5.
7. מיקום של קווים תוך הוורידים
- באמצעות שימוש בטכניקות נתיחה בוטות, חושף את וריד הצווארוריד בצד אחד של הצוואר. ברמה זו, וריד הצוואר מתפצל לשני גזעים גדולים, עורקים קדמיים ואחוריים פנים.
- בצע את השלבים הבאים פעמים, אחד שנקבע לכל אחד מהגזעים האלה:
- בעזרת 4 או 5 מלקחי דומון, להפריד בזהירות הווריד מהרקמה מקשרת סביבתה.
- באמצעות 7 מלקחי דומון, להחליק 2 אורך של 6.0 תפרי משי תחת הווריד. להפריד ביניהם ככל האפשר לאורכו של הווריד.
- הנח קליפ כלי קטן בצד הפרוקסימלי של הווריד (הצד הקרוב ללב), ולקשור את הצד הדיסטלי של הווריד.
- בעזרת מספרי איריס יפים מאוד, עושה חתך רוחבי קטן בווריד, בזהירות רבה, שלא סעיף הווריד לחלוטין.
- הכנס קטטר 1Fr מראש ו( premicath, Vygon) בפתיחה, עד לקליפ הכלי.
- מחזיק את הווריד והקטטר יחד ב4 מלקחי דומון, להסיר את סרטון הכלי בזהירות, ואז דוחף את הקטטר כמה מורמילימטרי דואר לווריד.
- Secure את הקטטר על ידי קשירתו בשני התפרים בשני הצדדים של הכניסה.
- אחד מהצנתרים מחובר למזרק או משאבת מזרק להזריק מינונים משלימים של חומרי הרדמה בעת צורך (כל 10-30 דקות בדרך כלל). המנה הרביעית היא גם 6 מ"ג / ק"ג של נתרן פנטוברביטל או 1250 40 מיקרוגרם / ק"ג / דקה של קטמין / 12 xylazine. קטטר האחר מחובר למשאבת מזרק לעירוי תוך ורידים איטי (50 μl / שעה) של 4% פתרון גלוקוז המכיל 3 NaHCO (% 1) וplasmion (14%).
8. סגור את עור הצוואר עם מחט ותפר, והחזר את העכבר לתנוחת שכיבה
9. נתיחה של שרירי הגפה-הינד ועצבים
- בעזרת מספריים, עושה חתך מהחלק העליון של הירך בגיד אכילס. להפריד את העור מהשרירים הבסיסיים, נזהר שלא לפגוע בכלי דם. לצרוב במידת צורך.
- זהירות לנתח את Femoris Biceps. לצרוב / קשירה כנדרשת כדי למנוע דימום. Biceps Femoris ניתן להסיר לחלוטין או פשוט נשכב על מנת לחשוף את גיד הנשה ואת שרירי Triceps Surae.
- לנתח את עצב Sural.
- שימוש בחוט משי 8/0, לקשור את חלקו האחורי של עצב Peroneal קומון וחתוך לדיסטלי את הקשר. מנתח את העצבים כל הדרך למעלה, קרוב לירך ככל האפשר.
- זהה את עצב הטיביאלי בין עצבי Peroneal וSural הנפוצים. בין הענפים השונים של עצב הטיביאלי, לזהות ענפי innervating Surae Triceps מהענפים שהולכים עמוקים יותר (יקרא להלן עצב הטיביאלי).
- שימוש במשי 8/0חוט, לקשור יחד את כל הסניפים של עצב הטיביאלי תוך שמירה על שלמות הסניפים innervating Surae Triceps. חותך את עצב הטיביאלי distally לקשר ולנתח את העצבים ככל האפשר.
- מכסה את כל hindlimb עם גזה ינקה עם מי מלח כדי למנוע dessication בעת הליך בשלב הבא.
10. Laminectomy
- בעזרת מספריים, עושה חתך לאורך עמוד השדרה. להפריד את העור מהשרירים הבסיסיים.
- לעשות שני חתכים בכל צד של החוליות להפריד את השרירים תת עורי. ואז חותך כל גיד של השרירים המחברים בצד של חוליות בכל צד.
- שימוש במלקחיים קהים ומגרדת עדינה, הסר את שארית השרירים בצד הגבי של החוליות סביב תהליכי spinous לזהות בבירור כל חוליה וחוליה.
- זהה את חוליות T13 וL1. T13 היא החוליה האחרונה שיש לי צלעות מצורפות. עמוד שדרת wחולה להיות משותק באמצעות מהדק קנינגהם חוט השדרה (בחוליות Stoelting ושות). מקם את התפסים בעמוד שדרה בכל צד של T13 וL1. יש להיזהר שלא לדחוס את חוט השדרה, אך הכניס קצת מתח בציר האורך. בדקו שעמוד השדרה מאובטח היטב על ידי לחיצה בעדינות עם מלקחיים.
- שימוש rongeurs העדין, מסיר את תהליך השדרה אז רבדים על T13 וL1, ובכך חושף את חוט השדרה.
- כריכת חוט השדרה נחשף בפיסות קטנות של כותנה או spongel ינקו עם מי מלח למניעת התייבשות.
- הנח אמבטית מנהג עשה פלסטיק על גבי החלק האחורי, המקיפה את חוט השדרה. אבטח את האמבטיה בדירה באמצעות חוט משי 4/0. ודא שהאמבטיה היא עמידה למים על ידי אטימתה עם האיטום Kwik-יצוק (WPI).
- ברגע Kwik-היצוק התייבש, הסר את כיסוי כותנת חוט השדרה, ולמלא את האמבטיה עם שמן מינרלים.
- באמצעות 5 מלקחיים דומון ומספרי איריס יפים מאוד, משוך בעדינות על תאומת הדורהr סביב חוט השדרה, ולפתוח אותו במידת ההאפשר הוא בכיוון. מקפל את הדורה בכל צד של עמוד השדרה.
- מנמיך את הפלטפורמה המוגבהת שעליה את העכבר משקר כדי לשמור אותו הושעה על ידי מהדק השדרה.
- השתמש במהדק חוליות אחרת כדי לצבוט את תהליך spinous של אזור עצם העצה לתומך באזור האחורי של החיה.
- מהדק שלישי נועד כדי לשתק hindlimb וקרסול ימין, מתח בזווית של 90 מעלות בברך.
11. Dissection הגיד אכילס
- עם האיבר הכפוף בזווית של 90 מעלות בברך ובקרסול, להסיר את התחבושת מכסה את אזור hindlimb, ולנתח את הגיד ללא רקמה הסובבת אכילס. לנתח ככל האפשר Surae Triceps מרקמות גם כן.
- חותך את הגיד של שריר Plantaris הקרוב לcalcaneus, חתך אותו שוב כדי להסיר את הגיד לגמרי.
- באמצעות מחט מושחלת, לצרף חוט משי 6/0 עד הדואר גיד אכילס ולהפוך את קשר משולש סביב הגיד.
- הנח את מתמר הכח הקרוב לפקעת, לחתוך חלק הדיסטלי של הגיד, ולצרף אותו למתמר הכח באמצעות חוט משי.
- הוסף שני אורכים של חוט נירוסטה מתחת fascia של שרירי Surae triceps. חוטים אלה מחוברים למגבר AC תאי להקלטת EMG.
- הנח את עצב Peroneal המשותף ועצב הטיביאלי על שתי אלקטרודות וו דו קוטביות.
- הנח את עצב Surae Triceps על הקתודה של האלקטרודה וו, עם האנודה נוגעת שרירים סמוכים.
- חבור את כל אלקטרודות הגירוי ליחידת בידוד.
- הנח אלקטרודה כדור על פני השטח הגבי של חוט השדרה, מחוברים למגבר AC תאי להקליט פוטנציאלי טבורי dorsum. הנח אלקטרודה השוואתית Ag / AgCl במגע עם שריר אחורי.
12. שלב שנתי עשר
לגרות את עצבי Surae Tricepsבאמצעות דופק 50 μsec מרובע של עצמה גוברת בתדירות נמוכה (<1 רץ) עד משרעת עווית מרבית הוא ציין. זז לאט את מתמר הכח כדי למתוח את השרירים תוך ניטור המשרעת של תגובת העווית עד משרעת העווית מגיעה למקסימום.
13. הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים
מנקודה זו ואילך, טכניקות אלקטרו סטנדרטיות משמשות להכנת האלקטרודה תאית, לחדור נוירון בחוט השדרה ולזהות אותו כmotoneuron.
- משוך micropipette זכוכית ל~ טיפ 1 מיקרומטר באמצעות פיפטה חולץ (P-97 micropipette פולר, מכשירי סאטר). מלא את האלקטרודה בתמיסת 3M KCl (התנגדות של האלקטרודה 10-20 MΩ).
- שימוש micropositioner, לנהוג micropipette, מחובר למגבר תאי (Axoclamp 2B, מכשירי האקסון) לחוט השדרה. פקח את פוטנציאלי השדה המקומיים שהושרו על ידי הגירוי של דוארach עצבים כדי לאתר את הברכה המוטורית של Surae Triceps.
- זהירות להתקרב תאי עצב אחראים משוערים תוך ניטור ההתנגדות של microelectrode. כאשר דוחפים נגד קרום, ההתנגדות מגבירה. חדירה מתישהו ניתן להקל באמצעות הפונקציה "הזמזום" של המגבר התאי.
14. נוהל המתת חסד
בתום הניסוי, החיה מורדמת במנת יתר של פנטוברביטל (210 מ"ג / קילו IV), ואחרי עריפת ראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג כיצד לזהות motoneuron מקבוצת Surae Triceps לאחר חדירה. בעוצמת גירוי הנמוכה, רק EPSP monosynaptic ניתן לראות (איור 1 א). בעצמה גבוהה יותר, EPSP עשויה להיות גדול מספיק כדי לעורר "orthodromic" ספייק (1B איור). בעוצמת גירוי הגבוהה אף יותר, של הכל או לא antidromic ספייק מופיע, עם זמן אחזור קצר יותר מאשר EPSP monosynaptic (התרשים 1C). אם נוכחי מספיק מוזרק דרך microelectrode להפעיל ספייק, פעילות EMG ניתן להקליט על השריר לאחר עיכוב קצר, ואחריו עווית שריר (1D איור). לאחר זיהוי של motoneuron, תכונות אלקטרו ניתן לאפיין. לדוגמה, איור 2 ממחיש כיצד התנגדות הכניסה ניתן למדוד באמצעות hyperpolarizing וdepolarizing פולסים של נוכחי (איור 2 א), והתוויית הווריאציות של פוטנציאל הקרום לעומת כמות הזרם מוזרק (איור 2 ב ').
מאפייני ההתכווצות של יחידת המנוע גם ניתן ללמוד תוך שימוש בפרוטוקולים שונים של גירוי. לדוגמה, יחסי כוח בתדר ניתן להשיג על ידי הזרקת פולסים קצרים של זרם בתדרים שונים בmotoneuron (איור 3 א). כוח המצב היציב אז ניתן להתוות נגד התדירות של הקטניות הקיימות כדי לחשוף עקומת כוח בתדר sigmoidal (איור 3 ב ').
אם ההרדמה היא גם תחת שליטה, ניתן להקליט מיחידת מנוע יחידה עבור יותר מ 15 דקות. בפקיעה זו של זמן זה צריך להיות אפשרי להפעיל מגוון רחב של פרוטוקולים לאפיין גם motoneuron ואת מאפייני ההתכווצות של סיבי השריר זה innervates.
/ 4312/4312fig1.jpg "/>
איור 1. דוגמה לתהליך של זיהוי motoneuron. פנלים לתגובת C 3 ברציפות של motoneuron לגירוי חשמלי גובר של עצב הירך. הקו המקווקו האנכי מציין את הזמן של הגירוי. כל פנל הוא הפוטנציאל נרשם intracellularly הקרום (זכר עליון) ומטח מביא נרשם על פני השטח של החוט המותני (עקבות תחתונות). א בעצמה מעל הסף לגיוס של I afferents הקבוצתי (1.1 x T), EPSP הופיע בתגובה לגירוי החשמלי. EPSP היה monosynaptic בגלל ההשהיה המרכזית שלה, 0.4 אלפיות (קווים המקווקווים אנכיים קטנים), הייתה קצרה מדי למסלול הכולל סינפסה יותר מפעם אחת. ב גברת עוצמת הגירוי (2.0 x T) הגדיל את הגודל של EPSP עד שזה היה גדול מספיק כדי לעורר orthodromic ספייק. C. כאשר עוצמת הגירוי הייתה גדלה עוד יותר (2.1 x T), אקסון גויס, ופוטנציאל פעולה antidromic הופיע עם 1.2 אלפיות השהיה לגבי זמן הגירוי. בהתחשב באורך הולכה של 38mm, מהירות הולכת axonal הייתה 32 מ '/ ש'. ד כאשר זרם מוזרק (עקבות תחתונות) לתוך Triceps Surae motoneuron (motoneuron השונה מאשר בAC), ניתן מעורר פוטנציאל פעולה בסומא ( עקבות שניות מלמטה). פוטנציאל פעולה זה עובר למטה לאקסון, וחוצה את צומת נוירו השרירים, וגורם לפוטנציאל פעולת שרירים בסיבי שריר innervated ידי motoneuron נרשם. פוטנציאל הפעולה המורכבת (עקבות שניות מלמעלה) ניתן להקליט באמצעות אלקטרודות EMG. התכווצות העווית של סיבי השריר מוצגת בחצר העליונה. זמן ההתכווצות של יחידת המנוע ניתן להעריך מתגובת העווית בין שני קווים מהקווקווים האנכיים. איור מותאם בחלקו משופט 5.
e = "תמיד"> 
איור 2. הערכת התנגדות הכניסה של motoneuron. תגובה הממוצעת א לסדרה של פולסים נוכחיים (עקבות תחתונות) לאורך 500 אלפיות שני ונע בין 2 ל -3 NA. שימו לב לסאג בתגובת המתח של motoneuron (חץ מלא): המתח הגיע במהירות שיא (נקודה שחורה) לפני הייצוב לערך רמה נמוכה (ריבוע שחור). אחרי הדופק הנוכחי כבר הסתיים, ריבאונד (חץ ריק) מופיע. מגרש ב 'מהסטייה של המתח (ΔV) לעומת עוצמת הדופק הנוכחי. נקודות נמדדו בשיא של התגובה, ואילו ריבועים נמדדו בסופו של הדופק, כפי שהוא מתואר על ידי הסמלים בחלק העליון של האיור B1. קווים ישרים הם מתאימים ליניארי הטוב ביותר של התגובה לשיא (מקווקו) ותגובת הרמה (קו מנוקד). המדרונות של שורות אלה הם התנגדות כניסה לשיא ורמה אניהתנגדות nput של motoneuron, בהתאמה. איור מותאם משופט 5.
איור 3. . אפיון של יחסי כוח בתדר של יחידת מנוע השלושה הפנלים העליונים מראים: על העקבות התחתונות, פולסים של זרם החוזרים והנשנים בתדירות מצוין בראש כל פנל ומשמשים כדי לעורר פוטנציאל פעולה בmotoneuron; על 2 עקבות מהתחתית, פוטנציאל הקרום של motoneuron, מראה פוטנציאל פעולה בתדר של הקטניות; על העקבות השניות מלמעלה, פעילות EMG; על העקבות העליונות הכח הנוצר על ידי הרכבת של פוטנציאל פעולה. הפנל התחתון מציג את תרשים הסיכום של כמות הכח הגיע ברכבות הבודדות זמם נגד התדירות של פוטנציאלי פעולה בכל רכבת. העקומה היא sigmoidal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההכנה המתוארת כאן היא הראשונה שמאפשר, בעכבר הבוגר, ההקלטה תאית סימולטני של motoneuron המותני והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי שריר innervated ידי האקסון שלו.
בשל גודלו הקטן של בעלי החיים, את המיומנויות הנדרשות להכנה כירורגית זה יכול להיות מאתגר לרכוש. עם זאת, ברגע שכישורים אלה שולטים, כל הניתוח יכול להתבצע בשלוש שעות, ובעלי החיים יכולים לשרוד לעד 7 שעות ויותר לאחר תום ההליך כירורגי להקלטות. ההצלחה של טכניקה זו היא למעשה מותנית בניהול בהרדמה. זה הוא בעל חשיבות קריטית ללנטר בזהירות כפרמטרים פיסיולוגיים רבים ככל האפשר (טמפרטורת ליבה, PCO 2, קצב לב וכו ') וכדי לשמור עליהם הוא הטווח הפיזיולוגי שלהם. כל סטייה חייבת להיות מתוקן מיידי למשל על ידי הגדלה / הקטנת כוח hאכילת שמיכה, כדי להתאים את הפרמטרים של מכונת ההנשמה, או מוסיף עוד הרדמה. זה הניסיון שלנו כי המצב הפיזיולוגי של העכבר יכול לקחת סיבוב מהיר מפתיע לרעה, אם לבו לא שולם בכל העת לפרמטרים אלה.
יציבות מכאנית היא בעלת חשיבות עליונה כאשר מנסים להשיג הקלטות תאיות. זה נכון במיוחד בvivo, שם תאי עצב אחראים יכולים לנוע תחת ההשפעה של לחץ דם, נשימה והתכווצויות שרירים. למרות שזה בלתי אפשרי ליציבות מושלמת ערבות, הנוהל שלנו מאפשר הקלטות יציבות של תאי עצב אחראים לעשר דקות או יותר. זו מושגת על ידי שילוב של ארבעה מלחציים לשתק את עמוד השדרה ואת עצמות הרגל. שני תפסים ממוקמים קרוב ככל האפשר מאתר laminectomy כדי לשתק את חוט השדרה באזור זה. מצאנו כי הפחתה באורך של חוט שדרה בין שני תפסים, כמו גם מפעיל קצתמתח על העצמות ספק ייצוב טוב מאוד, כפי שהיינו מסוגל לשמור הקלטות תאיות למספר שעות בחיות משותקות 5. עם זאת, במקרה הנוכחי, בעלי החיים אינם משותקים, ואת השרירים חופשיים חוזה, במיוחד כאשר גירוי עצב הירך. זו הסיבה מדוע אנו לייצב את שלד הרגל כולה באמצעות שני חבקים, אחד ברמת העצה, לשתק את כל הירך ולכן מניעת התכווצויות שרירים מלהיות מועברים לעמוד השדרה, ואחד בקרסול כדי לשתק את הרגל ב90 זווית של °.
באמצעות טכניקה זו, ניתן לזהות את הסוג הפיזיולוגי של motoneuron מבוסס על פרופיל הכח של יחידת המנוע 13. תאי עצב אחראים יכולים להיות מסווגים כאיטי או מהיר המבוסס על זמן התכווצות עוויתם, ועמיד בFatigable או עייפות המבוסס על יכולתם כדי לקיים את הכח נתון במהלך גירוי חוזר על עצמו. ככזה, ההכנה provi זה des יתרון מובהק על פני בהכנות מבחנה. בתנאים במבחנה, חוט השדרה מופק מגופו של בעל החיים והניח בצלחת שלמה או פרוסים. בגלל שכבת המיאלין המקיף את החומר האפור, חמצון נכון ניתן להשיג רק בבעלי חיים שבו ילוד myelination אינו שלם 14. התפתחויות טכניות האחרונות אפשרו הקלטות של תאי עצב אחראי שדרה בפרוסות 15-17 מבוגרים, לעומת זאת, גישה זו לא להקל על החסרון העיקרי של הקלטות במבחנה, והוא שאין דרך לזהות את הסוג הפיזיולוגי של motoneuron נרשם (S, FR, או FF, או אפילו אלפא מול גאמה), ולאלץ את experimentalist לברכה יחד הקלטות מתאי עצב אחראים, כי הם מהותיים אחרים, במונחים של פונקציה, תכונות אלקטרו ותוכן חלבון (ראה מנואל & Zytnicki, 2011 18 לסקירה מהסוגים השונים של תאי עצב אחראים).
= "Jove_content"> לבסוף, ראוי לציין כי האפשרויות שמציעות טכניקה זו הן רבות. ואכן, אלה בהקלטות vivo יכולים להיות מבוצעים בבעלי חיים מהונדסים גנטי כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של השינוי הספציפי הזה על תפקוד המערכת המוטורית: לייצר כוח. הכנה זו היא גם מאוד מבטיחה עבור המחקר במחלות ניווניות כמו טרשת נפוצה אדם גריג לרוחב (ALS) או ניוון שרירי שדרה (SMA). מודלים גנטיים שאכן נוצרו המחקים את התסמינים של מחל ההיכר 10,11 אלה. ההכנה החדשה המתוארת כאן פותחת את האפשרות של לימוד תפקידם של צומת neuromuscular במחלות אלה על ידי בדיקת התנהגותם של תאי עצב אחראים וסיבי שרירים (גם באופן עצמאי ויחד) במהלך התקדמות המחלה. לאחרונה, שתי קבוצות עצמאיות הצליחו לפתח decerebrated בהכנת עכבר vivo שהוא מציג תנועה ספונטנית או פיקטיביתנועה 19,20. אם סוג של יציבות הקלטה שאנו צופים באמצעות ההליך מתואר כאן יכול להיות מושגת לאחר decerebration, זה היה מהווה כלי אדיר למחקר לא רק של תאי עצב האחראים, אלא של כל מעגלי השדרה מראש הרכב שהיה המעורבים ביצירת הקצב של התנועה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו התאפשרה הודות לתמיכה כספית מFondation pour la המשוכלל והנדירה Médicale (FRM), המלגה הבתר מילטון Safenowitz למחקר ALS (ALS אגודה), מענקי NIH NINDS NS05462 וNS034382, וANR גרנט HyperMND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
References
- Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
- Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
- Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
- Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
- Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
- Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
- Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
- Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
- Burke, R. E. Motor Unit Types - Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
- Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
- Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
- Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
- Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).
Tags
Neuroscience גיליון 70 פיזיולוגיה ביופיסיקה אנטומיה רפואה רכב מערכת חוט שדרה הקלטות תאיות תאי עצב אחראים EMG חיל גב תחתון עצב מוח עכבר מודל חיהErratum
Formal Correction: Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo
Posted by JoVE Editors on 01/04/2013.
Citeable Link.
A correction was made to Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo. There was an error in the name of one author, Marin Manuel. The author's name has been corrected to:
Marin Manuel
instead of:
Manuel Marin
