Summary

Het gebruik van Time lapse microscopie om Anoxie-geïnduceerde Suspended Animation Visualiseer in<em> C. elegans</em> Embryo's

Published: December 03, 2012
doi:

Summary

Hier beschreven wordt een<em> In vivo</em> Techniek image subcellulaire structuren dieren blootgesteld aan anoxie met een gasstroom door microincubation kamer in combinatie met een draaiende schijf confocale microscoop. Deze methode is eenvoudig en flexibel genoeg om een ​​aantal experimentele parameters en modelsystemen passen.

Abstract

Caenorhabdits elegans is uitgebreid gebruikt in de studie van stressbestendigheid, dat wordt vergemakkelijkt door de transparantie van de volwassene en embryo fasen alsook door de beschikbaarheid van genetische mutanten en transgene stammen die talloze fusie-eiwitten 1-4. Daarnaast kunnen dynamische processen zoals celdeling worden weergegeven met fluorescent gemerkte reporter eiwitten. De studie van mitose kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van time-lapse experimenten in diverse systemen waaronder intacte organismen, vandaar de vroege C. elegans embryo is geschikt voor deze studie. Hier gepresenteerde een techniek waarbij in vivo beeldvorming van sub-cellulaire structuren in reactie op anoxische (99,999% N2, <2 ppm O 2) spanning kan op eenvoudige gasstroom door instellen op een krachtige microscoop. Een microincubation kamer wordt gebruikt in combinatie met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoopeen gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo maken. Met GFP-gelabelde gamma tubuline en histon kan de dynamiek en arrestatie van celdeling worden gecontroleerd voor, tijdens en na blootstelling aan een zuurstofarme omgeving. De resultaten van deze techniek zijn hoge resolutie, gedetailleerde video's en foto's van cellulaire structuren binnen blastomeren van embryo's worden blootgesteld aan zuurstoftekort.

Protocol

1. Monstervoorbereiding Produceren of verkrijgen geschikte transgene C. elegans stam van belang het gebruik van transgene methoden of van Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) of collega. In dit geval gebruiken we stam TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP, pie-1 :: GFP :: H2B) 5 tot chromosomen en centrosomen visualiseren als markers voor de celdeling. Genereer een gesynchroniseerde bevolking door het gebruik van een van de drie manieren: 1) desintegreren zwangere v…

Representative Results

C. elegans embryo's worden blootgesteld aan ernstige zuurstoftekort (anoxie) in staat zijn om te overleven met de arrestatie van biologische processen zoals ontwikkeling en celdeling 7. De anoxie-geïnduceerde arrestatie van celdeling kan worden gecontroleerd, een sub-cellulair niveau, door een microincubation kamer in samenhang met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoop om een gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo creëren <st…

Discussion

Zuurstoftekort en Suspended Animation

Hoewel blootstelling aan ernstige zuurstoftekort kan fataal zijn voor een aantal organismen, sommige organismen zijn in staat om blootstelling aan zuurstoftekort te overleven. In het geval van C. elegans, overleving van anoxie blootstelling is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de reactie op anoxie wordt de toegang tot een omkeerbare toestand van schijndood, waarin een aantal waarneembare biologische processen worden gearresteerd. Celdelin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij willen graag onze waardering uit te drukken voor de input en opmerkingen van de leden van de Padilla Lab. Nematode stammen in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). We erkennen en Dr Lon Turnbull bedanken voor technische bijstand met confocale microscopie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIÈRE) naar PAP

Materials

Reagents/Equipment Composition
Hypochlorite solution     0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer     3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Glass microscope slides Fisher Scientific 12-550-343 3″x1″x1.0 mm
Round micro coverglass Electron Microscopy Sciences 72223-01 25 mm Diameter
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100ml  
Anesthetic     0.5% tricaine, 0.05% tetramisole
Leiden Closed Perfusion Microincubator Harvard Apparatus 650041  
UHP Nitrogen Calgaz (Air Liquide)   >99.9990% N2 <2 ppm O2
Plastic tubing VWR 89068-468 0.062″ ID x 0.125″ OD
Spinning Disk Confocal Microscope McBain Systems   Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera.

References

  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).

Play Video

Cite This Article
Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).

View Video