Hier beschreven wordt een<em> In vivo</em> Techniek image subcellulaire structuren dieren blootgesteld aan anoxie met een gasstroom door microincubation kamer in combinatie met een draaiende schijf confocale microscoop. Deze methode is eenvoudig en flexibel genoeg om een aantal experimentele parameters en modelsystemen passen.
Caenorhabdits elegans is uitgebreid gebruikt in de studie van stressbestendigheid, dat wordt vergemakkelijkt door de transparantie van de volwassene en embryo fasen alsook door de beschikbaarheid van genetische mutanten en transgene stammen die talloze fusie-eiwitten 1-4. Daarnaast kunnen dynamische processen zoals celdeling worden weergegeven met fluorescent gemerkte reporter eiwitten. De studie van mitose kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van time-lapse experimenten in diverse systemen waaronder intacte organismen, vandaar de vroege C. elegans embryo is geschikt voor deze studie. Hier gepresenteerde een techniek waarbij in vivo beeldvorming van sub-cellulaire structuren in reactie op anoxische (99,999% N2, <2 ppm O 2) spanning kan op eenvoudige gasstroom door instellen op een krachtige microscoop. Een microincubation kamer wordt gebruikt in combinatie met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoopeen gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo maken. Met GFP-gelabelde gamma tubuline en histon kan de dynamiek en arrestatie van celdeling worden gecontroleerd voor, tijdens en na blootstelling aan een zuurstofarme omgeving. De resultaten van deze techniek zijn hoge resolutie, gedetailleerde video's en foto's van cellulaire structuren binnen blastomeren van embryo's worden blootgesteld aan zuurstoftekort.
Zuurstoftekort en Suspended Animation
Hoewel blootstelling aan ernstige zuurstoftekort kan fataal zijn voor een aantal organismen, sommige organismen zijn in staat om blootstelling aan zuurstoftekort te overleven. In het geval van C. elegans, overleving van anoxie blootstelling is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de reactie op anoxie wordt de toegang tot een omkeerbare toestand van schijndood, waarin een aantal waarneembare biologische processen worden gearresteerd. Celdelin…
The authors have nothing to disclose.
Wij willen graag onze waardering uit te drukken voor de input en opmerkingen van de leden van de Padilla Lab. Nematode stammen in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). We erkennen en Dr Lon Turnbull bedanken voor technische bijstand met confocale microscopie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIÈRE) naar PAP
Reagents/Equipment | Composition | ||
Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |