Summary
这里描述的是一个
Abstract
已caenorhabdits线虫广泛使用在研究的胁迫抗性的成人和胚胎阶段的透明度，以及由遗传突变体和转基因株表达融合蛋白1-4无数的可用性，这是便利的。此外，可以被视为使用荧光标记的记者蛋白的动态过程，如细胞分裂。有丝分裂的研究，可以促进通过使用时间推移实验在各种系统中，包括完整的生物体，因此早期C.线虫的胚胎非常适合这项研究。这里介绍的是一种技术，其中在响应于缺氧（纯度为99.999％的N 2的 <2 ppm O 2） 在体内成像的亚细胞结构应力是可能使用一个简单的气体流通过安装在一个高功率的显微镜。 ，甲microincubation室中使用结合用氮气流过和纺丝盘共聚焦显微镜创建一个受控的环境，在该环境中的动物可以在体内成像。用GFP标记的伽玛微管蛋白和组蛋白的动力学和逮捕的细胞分裂，可监视之前，期间和之后暴露于缺氧的环境。这种技术的高分辨率，详细的视频和图像的细胞结构内暴露于缺氧的胚胎卵裂球的结果。
Protocol
1。样品制备
- 生产或获得适当的转基因C.线虫应变计用转基因的方法，或从秀丽隐杆线虫基因联合中心（CGC），或同事。在这种情况下，我们使用的菌株TH32（ 馅饼1 :: TBG-1 :: GFP饼1 :: GFP :: H2B）5可视化标记细胞分裂染色体和中心体。
- 生成一个同步的人口使用以下三种方法之一：1）瓦解妊娠成人次氯酸钠溶液，并使用剩余的胚胎，2）种子盘上挑妊娠的成年人，让他们打下的胚胎1-2小时，或3）挑L4幼虫从混合的人口和移动到一个新的种子板。
- 成长线虫在20°C至妊娠年轻的成年，这将需要约96小时孵化，从L1幼虫的72小时或24小时后L4蜕皮。 在子宫内的胚胎（2-20芯）含有大量的卵裂球核是最佳的成像子细胞和亚核的变化，分别。这种方法提供了一种手段来提供的青壮年人口早期胚胎，含有丰富的。
2。设置幻灯片的制备及缺氧商会
- 一个的湿热试验箱持有预制玻片，放置在一个大培养皿或垃圾桶的盖子覆盖着相当规模的湿纸巾。
- 准备熔融的2％琼脂糖在去离子H 2 O，通过加热在玻璃器皿的混合物通过微波或水浴。
- 将1-3滴在干净的玻璃载玻片温暖的琼脂糖。立即放置一个第二滑动翻转顶部琼脂糖滴（）垂直，按略有，使所得焊盘是薄的和不含气泡。
- 等待一段时间，冷却，慢慢分开的两个显微镜玻片上，留下一个完整的幻灯片的琼脂糖凝胶垫。重要的是要确保琼脂糖垫是足够薄，不interfe重新聚焦显微镜的能力。能力，可视化样本也是依赖于使用中的目标的特定的光学距离之间的显微镜，它可以改变。
- 使用干净的刀片塑造成一个小正方形琼脂糖凝胶垫。储存在准备湿热试验箱，直到准备使用。
- 仔细，使用相同的清洁刀片，采取琼脂糖垫的边缘，并将其转移到一个圆形的25 mm微型盖玻片从滑动，避免垫下方的气泡的积累。选择使用适合的圆形玻璃罩适当在microincubator。
- 添增下拉到琼脂糖垫作为麻醉剂使用的麻醉剂（0.5％三卡因，在M9缓冲液中的0.05％四咪唑）。选择5-10蠕虫和地方麻醉剂的下降。允许1-3分钟蠕虫停止运动。
- 成人的子宫内，观察胚胎代替解剖胚，的理由是，以减少潜在的胚胎desiccaTION和由于氮气流横跨胚胎运动。
- 立即加一滴卤烃油在上面的蠕虫病毒，防止蠕虫脱水，气体流过腔。由于卤烃油是粘性的，可以用一个的枪头或尖端的蠕虫挑到的蠕虫收集石油和下降的。
- 含有蠕虫的圆形玻璃罩一旦准备就绪后，莱顿的两半封闭的灌注microincubator是分离的，盖玻片，然后小心地直立放置到底环。双方室紧紧地握在一起，然后关闭。
- 然后将腔室连接到氮气罐经由柔性塑料管，并放置到适当的位置上的显微镜载物台（ 图1C）。在这个时候管和microincubator的应仔细检查是否有泄漏的油管和会议厅一侧的端口插头沿确保安全的依恋。人们可以AL如此轻率地散布少量的肥皂水，看是否有气泡，如果存在泄漏，这将形成管。
3。显微镜在缺氧
- 定位在低倍率的动物，然后，移动到合适的更高的放大倍率（此应用程序的64倍），图像的兴趣，如在成人的胚胎卵裂球或卵母细胞的组织或细胞。打开的488 nm的激光，以查看GFP信号和定位GFP融合蛋白在细胞中（s）的权益。
- 阻滞细胞周期阻滞在特定阶段的可视化（ 如下旬前期）确定一个卵裂球在前一阶段的细胞分裂（ 例如，后期相间或早期前期）。如中心粒的位置，染色体缩合开始，染色体上的位置和核膜的存在或不存在的细胞标记将帮助确定细胞周期阶段（ 图2A）。
- 用氮气（99.999％的腔室，然后灌注N 2 <2 ppm的O 2）。在这种情况下，我们使用了一个6 psi的压力，但是压力可能需要根据每个microincubator大小和在使用的管子的直径进行调整和优化。继续监测卵裂球（S）的氮充满室，调整焦平面必要的。
- 在这一点上，已经开始的时间推移成像。成像时，只要有必要进行捕获感兴趣的现象，在这种情况下前期逮捕和对接核膜内的染色体。图像不超过30分钟，每10秒一次。的图像捕获和设置，例如增益和激光功率的频率应根据需要调整。
- 取决于缺氧曝光后对细胞周期的阶段，在该时间内的胚胎回应缺氧环境可以改变。通常情况下，缺氧诱导前期逮捕发生在20-30分钟开始氮气流。我们观察到缺氧诱导细胞周期阻滞occuRRING于<20分钟。的图像可以在这段时间帧的方式获得，或可以分离出特定的图象，从时间推移系列购买。另外一个选择是使用视频显微镜胚胎中的亚细胞结构可视化。
- 要记录从缺氧诱导被捕的状态恢复，气体被关闭和室被允许返回到常氧的扩散，同时记录时间的推移系列。恢复出坞染色体的细胞周期进程，通常发生在5-20分钟的氮气。
- 请注意，在另外的实验中，一个缺氧指示器，刃天青，被安置在流体可通过的微容器，它被确定腔室变得缺氧氮气气流已经开始后约19分钟内的平均。
- Imaris，图像J或Photoshop处理图片和视频导入QuickTime显示。
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Representative Results
线虫胚胎暴露于严重缺氧（缺氧）是能够生存下去，逮捕生物过程，包括发展和细胞分裂的7。细胞分裂的缺氧诱导逮捕可以被监测，在亚细胞水平，通过用氮气流过和纺丝盘共聚焦显微镜结合使用microincubation室创建一个受控的环境，在该环境中的动物可以在体内成像（ 图1）。蜂窝结构可以监视在胚胎暴露于各种气体的环境中，在这种情况下，我们用GFP标记的伽玛微管蛋白和组蛋白H2B监控染色体结构在胚胎暴露于缺氧。
暴露于缺氧胚胎内，将冷凝的前期卵裂球的染色体和配合的内核周;的现象称为“染色体对接”（ 图2，电影1）。后复氧细胞周期的进程将恢复前期卵裂球染色体从核周的赤道板，显示发展到中期（ 电影2）。这种技术也被用于可视化停滞在细胞分裂的其他阶段或二价的染色体中的卵母细胞暴露于缺氧8雌雄同体。
图1实施例的显微镜和腔室设置用于在体内分析。蔡司反转与莱顿已关闭灌注Microincubator和所附的氮气罐（A）;显微镜载物台上，并microincubator（B）的共聚焦显微镜;的microincubator（C）的放大图。
图2，Hallmark缺氧诱导前期逮捕卵裂球。所示的代表图像的前期卵裂球于延时成像（A）卵裂球（B）暴露在常氧的胚胎或胚胎卵裂球缺氧暴露（C）30分钟后开始。缺氧诱导前期逮捕了染色体内的核外周和NEBD附近停靠的卵裂球的显示器被逮捕。比例尺= 5微米。
动画1。时间推移分析的卵裂球从常氧，缺氧。注意调整核周的染色体。气体流经开始28分钟后，图像被抓获。 点击这里观看电影 。
电影2。时间流失分析中的一个胚胎细胞缺氧恢复。作为氧返回到环境恢复细胞周期。 10分钟后，图像被抓获气体流过为c得到了缓解。 点击这里观看电影 。
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Discussion
缺氧和假死
虽然暴露于严重缺氧可能是致命的一些生物，有些生物能够生存暴露于缺氧。在的情况下的 C 线虫 ，缺氧的生存依赖于发育阶段，对缺氧的反应是一个可逆的假死状态进入观察到的生物过程中，一些被逮捕。细胞分裂，发展，运动，饮食和生殖过程停止，直到的氧气重新引入环境7,9。缺氧暴露的胚胎，细胞周期进程，可逆逮捕相间，下旬前期或中期。已被使用的，例如在固定的样品，并在体内 GFP融合蛋白的检测，它允许在缺氧环境的特定的亚细胞结构的成像的免疫染色的细胞生物学技术，有助于识别和表征在 C缺氧诱导假死的特定标志， 线虫 8,10,11。
胚胎和卵母细胞都显示针对特定蛋白质的荧光标记蛋白或抗体结合使用荧光显微镜，分析固定胚胎缺氧诱导假死的显着特点是容易看得见的。相间的卵裂球，胚胎暴露于缺氧，其特点是染色质的部分冷凝和逮捕的细胞周期进程与一些染色质排列在核外周9。尽管核的信封的故障（NEBD）表示最终承诺在缺氧的有丝分裂，前期逮捕的特点是通过的NEBD被捕，并在核外周10,12充分简明染色体的排列。中期逮捕，另一方面，其特征在于由逮捕染色体在中期板和部分解聚的微管，除其他的东西。缺氧诱导细胞周期阻滞在各个阶段是可逆的，并在复氧，细胞周期进程的简历。对照组和实验动物在缺氧24小时或更少的风险，是无法区分后恢复7。使用这里描述的方法的动物是能够生存缺氧曝光。
成像的分析与思考
这里介绍的方法使用的的TH32（UNC-119（ED3）ruIs32 III ddIs6）菌株的C.线虫 。该菌株表达两种荧光标记的蛋白质，便利的可视化的中心体和染色体。中心体的标志是ddIs6 [ 饼1 :: TBG-1 :: GFP + UNC-119（+），伽玛微管蛋白GFP标记的编码，定位于中心体在整个细胞周期。中心体的位置是指示性的细胞周期的阶段，并在计时缺氧实验是有帮助的。染色体标记的ruIs3中2 [UNC-119（+）馅饼1 :: GFP :: H2B]，它编码一个GFP标记的组蛋白，由种系特异性启动子5被驱动。因此，移动和本地化的卵裂球或卵母细胞的染色体内可以遵循。在发育中的胚胎，缺氧诱导的细胞周期阻滞，卵裂球，因此核之前，可以移动的焦平面成像的焦平面而需要调整。它可以按照一个以上的卵裂球或细胞核，但手动对焦蜂窝感兴趣对象的可能需要做的工作，以优化的可视化的多个感兴趣的细胞成分。这可能会限制除非是使用软件来跟踪一个特定的区域，并按照它能够自动的过程。我们还没有尝试的过程自动化。
为了优化协议的具体分析，可以考虑各方面的显微镜和遗传背景的利息13 （NPP-16（ok1839）），作为对照组使用相同的技术（ 例如，相同的缺氧曝光时间），并发现可以被捕获于30的表型（在这种情况下，异常的前期卵裂球逮捕）是敏感的胚胎缺氧10分钟的曝光。胚胎可以存活超过三天的缺氧使用其他的方法，我们没有发现的变异而导致的电阻在胚胎缺氧曝光（生存期延长近3天的接触）。
对于我们而言，我们是成像一个高度动态的细胞的过程，并且使用的是旋转盘共聚焦显微镜的快速图像采集。根据一个实验的特殊需要，它将需要以确定是否显微镜技术，不同的种可能更多的是ppropriate。
当选择或发展，此方法的转基因株，它是重要的是要考虑的特定的荧光基团的光漂白的趋势将被用作以及显微镜的灵敏度。在这一方法中的时间延时成像的使用可能会导致显着的光漂白在不强烈表达荧光蛋白的菌株。
有采集图像， 在体内使用这种方法时，要考虑的几大技术挑战和限制。由于腔室的大小，和潜在的耗时的实验性质，它可能是困难的，在一个短的时间量来分析大量的样品。实验需要大样本的大小往往可以搭配其他方法缺氧暴露产生很大的数据集，并在活体成像，可用于记录，验证或更仔细地检查表型的利益。的其他onally，如果实验需要检查期间长期暴露在特定时间点，与样品干燥化的问题可能会出现。尽管被覆盖卤化烃油，动物可能会开始变干，由于连续气体流动，因此限制了实验时间，可以缓解这一问题。此外，可以考虑使用的水合气体或一室，使湿度控制，以缓解干燥问题。
这种技术的优点之一是，低氧实验也是可行的。因此，为更多的氧气剥夺研究，可以简单地使用煤气罐指定的氧浓度（ 如 1％平衡与N 2 O 2）检查对缺氧的反应，而不是一个完全缺氧的环境。此外，另一种简单而灵活的变形例是使用其他气体包括O 2的水平（21％以上），H 2 S或CO，但是，使用这些气体的混合物的安全是一个魔女ŕ考虑，必须采取额外的预防措施14。
该技术的意义
虽然我们已经概述了这种方法暴露C.线虫缺氧和可视化标志，缺氧诱导假死使用非常特定的亚细胞标记物的胚胎内，在各种各样的实验的可能性，我们在这里描述的使用的室系统，这些有代表性的结果仅仅是一个单一的检测。氧气剥夺已被证明是在很宽的范围内的生物体影响许多细胞过程，并且通过利用这种技术，缺氧，缺氧，和各种各样的其他环境中的具体效果可以是可视化，并在体内拍摄。例如， 使用 C 线虫 ，该系统可被用于分析其他缺氧诱导的表型，如三卡因/ tetramizole麻醉剂（ 即咽泵送和reproductiv的使用允许Ë进程）。
这种方法中的应用并不限于为 C。 线虫 。通过腔室设置的这种气体流动提供一个简单的方法，用于暴露到低浓度的氧，同时捕获细胞的变化和可视化活性的荧光蛋白融合的细胞和整个生物体。例如，这种方法很容易适应酵母，细胞培养或小型无脊椎动物和脊椎动物胚胎的大小是不是太大室。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
从的帕迪拉实验室成员的意见和评论，我们想表达我们的感谢。线虫株在这项工作中所提供的秀丽隐杆线虫的遗传学中心，这是由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（NCRR）。我们承认并感谢经度特恩布尔博士激光共聚焦显微镜技术援助。这项工作已经得到了美国国家科学基金会（NSF-IOS，职业）的资助PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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