Summary
ここで説明
Abstract
Caenorhabditsエレガンスは、成人と胎児の段階の透明度だけでなく、融合タンパク質1-4の無数を表現する遺伝子変異体およびトランスジェニック系統の可用性によって促進されるストレス耐性、の研究に広く用いられている。また、このような細胞分裂のような動的なプロセスは、蛍光標識したレポータータンパク質を使用して表示できます。有糸分裂の研究は、無傷の生物を含む様々なシステムでタイムラプス実験の使用によって容易にすることができ、したがって初期のC.線虫の胚はよくこの研究に適しています。ここで紹介する無酸素に応答して、それによって細胞内構造のin vivoイメージング技術（99.999％N 2、<2 ppmのO 2）があるストレスが高倍率の顕微鏡でのセットアップを使用した単純なガスの流れを使用することで可能です。 microincubation室が通じ窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせて使用され動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することができます。 GFPタグガンマチューブリンやヒストン用いて、ダイナミクスと細胞分裂の逮捕は、酸素欠乏環境にさらされている間と後に、前に、監視することができます。この手法の結果は、酸素欠乏にさらされた胚の割球内の高解像度、詳細なビデオや細胞構造のイメージです。
Protocol
1。試料調製
- 適切なトランスジェニックCを生成または取得elegansはトランスジェニックの手法を用いて、関心のあるまたは線虫遺伝ストックセンター（CGC）や同僚への負担が少なくなります。細胞分裂のマーカーとして染色体や中心体を視覚化するために5;このケースでは、（PIE-1 :: GFP ::パイH2B-1 :: TBG-1 :: GFP）株TH32を使用しています。
- 3つの方法のいずれかを使用して同期化された集団を生成する：1）次亜塩素酸溶液中で妊娠成人を崩壊させ、残りの胚6を使用して 、2）播種板上に妊娠成人をピックアップし、それらを1〜2時間のために胚を置く、または3）L4を選ぶことができ混合集団とmoveから新しいシードプレートに幼虫。
- 孵化から約96時間かかります妊娠青年期、〜20℃、L1幼虫または24時間後、L4の脱皮から72時間で線虫を育てています。 子宮内で胚（2-20セル）IMAGに最適な大割球と核を含むるサブ携帯とサブ核の変化であった。この方法論は、初期胚の豊富な数を含む若年成人の集団を生成する手段を提供します。
2。スライドの調製と酸素欠乏症商工会議所は、設定
- 十分なサイズの蓋で覆われた大きなシャーレまたはビンの内側に湿らせたペーパータオルを配置することによって準備されたスライドを保持するために、湿潤チャンバーを作る。
- マイクロ波あるいは水浴を介してガラスに混合物を加熱することにより脱イオンH 2 Oで溶融2％アガロースを準備します。
- きれいなガラス顕微鏡スライド上に暖かいアガロースの1-3滴を置きます。直ちにアガロースドロップ（複数可）の上に垂直に反転した2枚目のスライドを配置し、その結果、パッドが薄いと気泡の自由になるように少し押します。
- クールゆっくりとスライドの1つ上のアガロースパッドはそのままにして2顕微鏡スライドを分解する時間を確保します。アガロースパッドがinterfeないように十分に薄いようにすることが重要です後で顕微鏡を集中する能力を使用して再。サンプルを視覚化する能力はまた、顕微鏡間で異なることができ、使用中の特定の目的の光学距離に依存する。
- 小さな正方形にアガロースパッドを形成するためにクリーンなかみそりの刃を使用しています。使用する準備ができるまで準備湿潤チャンバーに保管してください。
- 慎重に、同じクリーンなカミソリの刃を用いて、アガロースパッドの端を取るとラウンド25ミリメートルマイクロカバーガラス上にスライドからそれを転送し、パッドの下に気泡の蓄積を回避する。使用するために選択した丸いカバーガラスはmicroincubatorで適切にフィットします。
- 麻酔薬として使用するためのアガロースパッドに麻酔薬（0.5％tricaine、M9のバッファ内の0.05％tetramisole）のドロップを追加します。麻酔薬のドロップに5月10日ワームや場所を選ぶ。動きを止めるためにワームの1から3分を許可します。
- 成人子宮内の胎児を観察するための理論的根拠はなく、解剖した胚は、胚desiccaの可能性を最小限にすることですると胚全体で窒素ガスの流れによる移動。
- すぐにガスがチャンバを通して流されるように脱水からワームを防ぐために、ワームの上にハロカーボンオイルを一滴を追加します。ハロカーボン油は粘性があるので、一つはワームワームにオイル·アンド·ドロップを収集するために選ぶのピペットチップまたはチップを使用することができます。
- 一度ワームを含む円形カバーガラスの準備が整ったので、ライデン閉鎖灌流microincubatorの二つの部分を分離し、カバーガラスを慎重にボトムリングに直立して配置されます。チャンバーの両側は、その後しっかりと一緒に閉鎖されています。
- チャンバーはその後、柔軟なプラスチックチューブを介して窒素ガスをタンクに接続されており、顕微鏡ステージ（ 図1C）の適当な位置に配置されます。この時チューブとmicroincubatorは慎重にチューブのチャンバの側面に沿ってポートプラグの確実な取り付けを確実にすることによって、任意の漏れがないかチェックする必要があります。一つは、ALができますとても軽くリークが存在するかどう形成する気泡を探すためにチューブを介してSOAP少量の水を広める。
3。酸素欠乏症で顕微鏡
- 低倍率で動物を見つけ、その後、そのような大人の胚割球や卵母細胞のような関心の画像組織または細胞に適した高倍率（このアプリケーションの64倍）に移動します。 GFPシグナルを表示し、目的の細胞（s）のGFP融合タンパク質を見つけるために488nmのレーザーをオンにします。
- 細胞周期停止の特定の段階で逮捕を可視化するために（ 例えば、前期の後期）細胞分裂の前段階（ 例えば後期中間期または早期前期）で割球を識別します。このような中心小体の位置、染色体凝縮の開始、染色体の場所と核膜の有無などの細胞マーカーは、細胞周期段階（ 図2A）を識別するのに役立ちます。
- チャンバーは、窒素ガス（99.999％で灌流さN 2、<2 ppmのO 2）。我々は6 psiの圧力を使用しかし、この場合には圧力が各microincubatorのサイズと、使用中のチューブの直径に応じて調整し、最適化する必要があるかもしれません。窒素は、必要に応じて焦点面を調整し、チャンバーを埋めるように割球（s）を継続的に監視します。
- この時点で、タイムラプスイメージングが始まりました。イメージングは、核の内膜に染色体のこの場合前期の逮捕とドッキングで、興味のある現象を捕捉するために必要な限りのために行われている。画像は30分を超えないために10秒ごとに一度取られます。画像キャプチャとゲインやレーザパワー等の設定の周波数が必要に応じて調整されるべきである。
- 胚は無酸素環境に対応する時間は無酸素暴露時に細胞周期の段階に応じて変えることができる。一般的に酸素欠乏によって誘導された前期の逮捕は、窒素ガス流を開始してから20〜30分以内に起こる。我々は、酸素欠乏によって誘導された細胞周期停止occuを観察している<20分でRRING。画像はこの時間枠の間に取得することができる、または特定の画像は後でタイムラプスシリーズから単離することができる。追加のオプションは、胚で細胞内構造を可視化するビデオ顕微鏡を使用することです。
- 酸素欠乏によって誘導された逮捕された状態からの回復を文書化するために、ガスがオフになっていて、チャンバーをタイムラプスシリーズを記録しながら、拡散によって酸素正常状態に戻ることを許可されています。染色体の細胞周期の進行およびドッキング解除の再開は、典型的には窒素ガスをオフにして5〜20分以内に起こる。
- 別の実験では無酸素インジケーター、レサズリンは、フロースルーマイクロチャンバ内に配置されたことに注意してください、それは窒素ガスフローが開始された後チャンバーは約19分の平均で無酸素になることを決定した。
- 画像と動画は、Imaris、イメージJまたはPhotoshopを使用して処理し、ディスプレイ用のQuickTimeにインポートされます。
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Representative Results
深刻な酸素欠乏（無酸素）にさらさC. elegansの胚は、開発や細胞分裂7を含む生物学的プロセスを停止させることで生き残ることができます。細胞分裂の酸素欠乏によって誘導された逮捕は、動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することによる窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせてmicroincubation室を使用することによって、サブ細胞レベルで監視することができます（ 図1）。興味のある細胞構造は、様々なガス環境に曝さ胚でモニタすることができ、この場合、我々は酸素欠乏にさらされる胚の染色体構造を監視するためにGFPタグガンマチューブリンやヒストンH2Bを使用していました。
酸素欠乏にさらされる胚の中では、前期の割球の染色体が凝縮すると内側核周辺部に合わせ、 "染色体のドッキング"（ 図2、ムービー1）と呼ばれる現象である。再酸素の細胞周期の進行次第再開され、前期の割球の染色体は中期（ ムービー2）への進行を示す赤道板に核周辺から移動します。この手法は、細胞分裂や無酸素8にさらさ雌雄同体で卵母細胞の二価染 色体の他の段階で逮捕を可視化するために使用されてすることができます。
図1顕微鏡および in vivo で解析するために使用室のセットアップの例を次に示します。顕微鏡ステージとmicroincubator（B）、およびmicroincubatorの拡大図（C）のライデンとツァイス倒立共焦点顕微鏡は、灌流Microincubatorと結合している窒素ガスタンク（）を休館。
図2·H無酸素誘発前期逮捕割球のallmark。示さ正常酸素（B）または無酸素暴露（C）の30分後の胚の割球にさらされる胚の（）割球タイムラプスイメージングの開始時に前期割球の代表画像です。酸素欠乏によって誘導された前期は、内側の核周辺とNEBD近くドッキング割球ディスプレイ染色体が逮捕されて逮捕された。スケールバー=5μmである。
ムービー1。正常酸素から無酸素への移行における割球の経時的分析。核の周囲に合わせ染色体に注意してください。画像は始まっ通るガスの流れの後に28分を撮影した。 ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー2。酸素欠乏症から回復割球の経時的分析。環境細胞周期が再開への酸素に戻るので。 cは、イメージが通るガス流の後に10分捕獲されました緩和された。 ムービーを見るにはここをクリック 。
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Discussion
酸素欠乏と仮死状態
深刻な酸素欠乏への曝露は、いくつかの生物にとって致命的なことができますが、いくつかの生物が無酸素への暴露を生き抜いてきた。 Cの場合にはelegansは 、無酸素暴露の生存率は、発達段階や酸素欠乏に対する応答に依存するエントリが観察可能な生物学的プロセスの数が逮捕された仮死状態に可逆的である。酸素は環境7,9に再導入されるまで、細胞分裂、開発、運動、食べると生殖過程はやむ。酸素欠乏にさらされた胚の細胞周期の進行、間期、前期の後期または中期で可逆的に逮捕。酸素を奪われた環境で、特定のサブ細胞構造のイメージングを可能にするような固定したサンプルおよび in vivo GFP融合タンパク質アッセイにおける免疫染色などの細胞生物学的手法の使用は、識別および特性に尽力されましたCの酸素欠乏によって誘導された仮死状態の特定の特徴エレガンス 8,10,11。
胚および卵母細胞の両方が固定された胚を分析するために特定のタンパク質に対する蛍光標識されたタンパク質または抗体と組み合わせて、蛍光顕微鏡を用いて簡単に表示されている酸素欠乏によって誘導された仮死状態のマークされた特性を表示します。酸素欠乏にさらされる胚の割球間期は、クロマチンと核周辺9時に合わせ、いくつかのクロマチンを用いた細胞周期の進行の停止の部分縮によって特徴付けられる。核膜破壊（NEBD）が酸素欠乏症の有糸分裂への最終的なコミットメントを示しているが、前期の逮捕はNEBDの逮捕、および核周囲10,12で完全に凝縮された染色体のアラインメントによって特徴づけられる。中期停止は、他の一方で、他の中で、中期板と微小管の脱重合部分で、染色体の逮捕によって特徴付けられる物事。すべての段階で酸素欠乏によって誘導された細胞周期停止は可逆と再酸素化、細胞周期の進行を再開したのである。 24時間以下の無酸素暴露では、対照群と実験動物は回復7時に区別することはできません。動物は無酸素暴露を生き残ることができるここで説明する方法を使用します。
イメージング解析と考慮事項
Cの株;ここに示す方法は、TH32を（ddIs6 UNC-119（ED3）ruIs32 III）を利用エレガンス 。この株は、中心体と染色体の視覚化を促進2、蛍光標識されたタンパク質を発現する。中心体がddIs6によってマークされている[ パイ-1 :: TBG-1 :: GFP + UNC-119（+）]、そのGFPタグガンマチューブリンをコードしており、細胞周期を通して中心体に局在する。中心体の位置は、細胞周期の段階の指標であるとタイミング·無酸素の実験に便利です。染色体はruIs3によってマークされている2 [UNC-119（+）パイ-1 :: GFP :: H2B]、ヒストンタンパク質を標識したGFPをコードしており、生殖細胞特異的プロモーター5によって駆動されます。このように、割球や卵母細胞内の染色体の動きや局在が続くことができます。発生中の胚の中では、事前の酸素欠乏によって誘導された細胞周期停止、割球、従って核に、イメージングしながら焦点面を調整することが必要となっ焦点面の外に移動することができます。それは、複数の割球または核をフォローすることは可能ですが、興味のある携帯オブジェクトにマニュアルフォーカスは、関心のある複数の細胞成分の可視化を最適化するために行われる必要があるかもしれません。これは、1つは、特定の領域を追跡し、それに従うために、ソフトウェアを使用していなければ、プロセスを自動化する能力を制限する可能性がある。我々は、プロセスを自動化しようとしていない。
1の特異的なアッセイのためのプロトコルを最適化するには1、顕微鏡及び利息13の遺伝的背景の様々な側面を考慮することができる例えば、同じ無酸素露光時間）を使用して（NPP-16（ok1839））無酸素に敏感である胚を分析し、表現型（この場合は前期の割球の異常な逮捕）30内に捕捉することができることを見出した無酸素10への曝露の分。胚は、他の方法論を用いて酸素欠乏症の3日間生き残ることができる、我々は、胚における無酸素暴露（暴露の3日間を過ぎて延長生存）に対する抵抗の結果という変異を同定していない。
私たちの目的のために、私たちは非常にダイナミックな細胞プロセスイメージングであり、迅速な画像取得のため、回転するディスク共焦点顕微鏡を使用しています。実験の特定のニーズに応じて、それは顕微鏡技術の別の種類はそれ以上であってもよいかどうかを決定する必要がありますppropriate。
選択するか、またはこのメソッドの形質転換系を開発するとき、それは、特定の蛍光色素の退色傾向と同様に使用される顕微鏡の感度を考慮することが重要です。この方法論でタイムラプスイメージングの使用が強く蛍光タンパク質を発現していない株で漂白重要な写真につながる可能性があります。
この方法論を用いたin vivo で画像を収集する際に考慮すべきいくつかの技術的課題や制限があります。なぜなら室のサイズ、および実験の潜在的に時間のかかる性質のために、短時間で多数のサンプルを分析することは困難かもしれません。大きなサンプルサイズを必要とする実験は、多くの場合、大規模なデータセットを生成するために、無酸素暴露の他の方法と組み合わせることができ、in vivoイメージングでは 、ドキュメントを確認またはより密接に目的の表現型を調べるために使用することができます。 Additi実験は、長期暴露時の特定の時点で検査を必要とする場合onally、サンプルの乾燥には問題が生じる可能性があります。ハロカーボン油で覆われているにもかかわらず、動物は連続ガス流による乾燥するし始めるかもしれないので実験時間を制限することは、この問題を軽減することができます。また、1は、水和ガスや湿度制御は、乾燥の問題を軽減することができチャンバーを用いて検討することができます。
この手法の利点の一つは、低酸素症の実験も可能であるということです。したがって、追加の酸素欠乏の研究のために1は、単に低酸素状態ではなく、完全に無酸素環境への応答を調べるために、指定された酸素濃度（ 例えば 1％O 2 N 2とのバランス）でガソリンタンクを使用することができます。さらに、別のシンプルで柔軟性の修正は、21％以上のO 2濃度、H 2 SやCOなどの他のガスを使用することであるが、これらのガスを使用することの安全性は、魔女であるミックスrを考慮し、追加の対策は14を見られなければならない 。
技術の意義
我々は、C.を公開するには、この方法を概説しているが酸素欠乏と非常に特定のサブ細胞マーカーを用いた胚内の酸素欠乏によって誘導された仮死状態の特徴を視覚elegansは 、これらの代表的な結果は、単に私たちがここで説明するチャンバーシステムを用いた実験の可能性の広い様々な単一のアッセイである。酸素欠乏は、生物の広い範囲で細胞プロセスの数に影響を与えることが示されており、この技術を悪用して、無酸素症、低酸素症、および他のさまざまな環境の具体的な効果を可視化し、 生体内で捕獲することができる。例えば、Cを使用してエレガンス tricaine / tetramizole麻酔（ポンピング咽頭すなわちとreproductivの使用に許可されているように、このシステムは、酸素欠乏によって誘導される他の表現型を解析するために使用することができる電子プロセス）。
この方法論のアプリケーションは Cに限定されるものではなく、 エレガンス 。チャンバーセットアップを通してこのガス流量は、同時に細胞の変化を捕捉し、蛍光タンパク質融合物の活性を可視化しながら酸素の低濃度に細胞や生物全体を露出させるための簡単な方法を提供します。たとえば、このメソッドは、酵母、培養細胞や小さな無脊椎動物やサイズ室には大きすぎではありません脊椎動物の胚に容易に適用可能である。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、入力とパディーヤラボのメンバーからのコメントに感謝の意を伝えたい。この作品で線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫の遺伝学センターから提供された。我々は、共焦点顕微鏡について技術的な支援のために博士ロンターンブルを認め、感謝しています。この作品は、PAPに国立科学財団（NSF-IOS、キャリア）からの助成金によって支えられてきた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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