Summary
Descrito aqui é um
Abstract
Caenorhabdits elegans tem sido amplamente utilizado no estudo da resistência a fadiga, o que é facilitado pela transparência das fases adultas e de embriões, assim como pela disponibilidade de mutantes genéticos e estirpes transgénicas que expressam uma variedade de proteínas de fusão 1-4. Além disso, os processos dinâmicos, tais como a divisão celular pode ser visualizado utilizando proteínas repórter fluorescente etiquetado. O estudo da mitose pode ser facilitado através da utilização de experiências de lapso de tempo de vários sistemas, incluindo organismos intactos, assim a C. precoce embrião elegans é bem adequado para este estudo. Apresentado aqui é uma técnica pela qual imagem in vivo de sub-estruturas celulares em resposta a anóxica (99,999% N 2; <2 ppm O 2) o estresse é possível através de um fluxo de gás através de simples instalação em um microscópio de alta potência. A câmara microincubation é usado em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratóriopara criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados in vivo. Usando GFP-tagged tubulina gama e histona, a dinâmica ea prisão de divisão celular podem ser monitorados antes, durante e após a exposição a um ambiente privado de oxigênio. Os resultados desta técnica são de alta resolução, vídeos e imagens detalhadas das estruturas celulares dentro blastômeros de embriões expostos à privação de oxigênio.
Protocol
1. Preparação da Amostra
- Produzir ou obter apropriado transgênico C. elegans estirpe de interesse, utilizando metodologias de transgênicos ou de Caenorhabditis Genética da Center (CGC) ou colega. Neste caso estamos usando tensão TH32 (torta-1 :: TBG-1 :: GFP; torta-1 :: GFP :: H2B) 5 para visualizar cromossomos e centrossomas como marcadores para a divisão celular.
- Gerar uma população sincronizada usando um dos três métodos: 1) se desintegrar adultos grávidas em solução de hipoclorito e usar embriões restantes 6, 2) escolher adultos grávidas em uma placa sem sementes e deixá-los colocar embriões para 1-2 horas, ou 3) escolher L4 larvas de uma população mista e mudança para um novo prato semeado.
- Nematóides crescer a 20 ° C a gravid idade adulta jovem, que terá cerca de 96 horas de incubação, 72 horas a partir de larvas L1 ou 24 horas pós muda L4. Embriões (2-20 células) no útero conter blastômeros grandes e núcleos que são ideais para imagalterações profundas sub-celular e sub-nuclear, respectivamente. Esta metodologia proporciona um meio para gerar uma população de adultos jovens que contêm um número abundante de embriões precoces.
2. Preparação de slides e anoxia Câmara Configurar
- Fazer uma câmara húmida para segurar lâminas preparadas pela colocação de uma toalha de papel húmido no interior de uma caixa de Petri grande ou bin coberto com uma tampa de tamanho suficiente.
- Prepare fundido agarose a 2% em H2O desionizada aquecendo mistura em recipientes de vidro por meio de banho de ondas ou água.
- Coloque gotas 1-3 de agarose quente sobre uma lâmina de vidro limpa microscópio. Colocar imediatamente uma segunda lâmina invertida perpendicularmente por cima da gota de agarose (s), pressione ligeiramente de modo que a almofada resultante será fina e livre de bolhas de ar.
- Dê tempo para esfriar e, lentamente, desmontar as duas lâminas de microscópio, deixando o bloco de agarose intacto em um dos slides. É importante assegurar a almofada de agarose é suficientemente fino para não interferindore com a capacidade de focar o microscópio depois. Capacidade de visualizar de amostra é também dependente da distância óptica específica do objectivo de utilização, que pode variar entre os microscópios.
- Use uma lâmina de barbear limpa para moldar almofada de agarose em um pequeno quadrado. Armazenar na câmara preparado úmido até que esteja pronto para uso.
- Com cuidado, utilizando a mesma lâmina limpa, tomar a borda do bloco de agarose e transferi-lo a partir da corrediça para uma lamela 25 mm de diâmetro, micro, evitando a acumulação de bolhas de ar por baixo da almofada. A lamela rodada selecionado para usar apropriadamente se encaixa no microincubator.
- Adicionar uma gota de anestésico (0,5% tricaina, tetramisole 0,05% em tampão M9) sobre a almofada de agarose para o uso como um anestésico. Escolha vermes 5-10 e coloque na gota de anestésico. Permitir 1-3 min para vermes para cessar o movimento.
- O racional para a observação de embriões no útero de adultos, em vez de embriões dissecados, é o de minimizar o potencial de embrião desiccação e de movimento, devido ao fluxo de gás de azoto através do embrião.
- Imediatamente adicionar uma gota de óleo halocarbono em cima dos vermes para prevenir os vermes de desidratação como o gás flui através da câmara. Uma vez que o óleo é viscoso halocarbono pode-se usar uma ponta de pipeta ou ponta de um verme escolher para recolher o óleo e cair sobre os vermes.
- Uma vez que a lamela circular contendo as minhocas está pronta, as duas metades do Leiden fechado perfusão microincubator são separadas, e a lamela é então cuidadosamente colocada de pé sobre o anel inferior. Os dois lados da câmara são então fechada hermeticamente em conjunto.
- A câmara é então ligada ao tanque de gás de azoto através do tubo de plástico flexível e colocado no local adequado na platina do microscópio (Figura 1C). Neste momento, o tubo e microincubator devem ser cuidadosamente verificados para identificar qualquer fuga ao assegurar uma fixação segura do tubo e dos tampões de porta ao longo do lado da câmara. Pode-se altão levemente espalhar uma pequena quantidade de água de sabão ao longo do tubo de olhar para as bolhas, as quais irão formar um vazamento, se estiver presente.
3. Microscopia em Anoxia
- Localize animais com menor ampliação, então, mudar-se para a ampliação adequada superior (64x para esta aplicação) para o tecido de imagem ou células de interesse, como blastômeros embrionárias ou ovócitos em adultos. Ligar o laser de 488 nm para visualizar o sinal GFP e localizar a proteína GFP na célula (s) de interesse.
- Para visualizar a prisão na fase específica de parada do ciclo celular (por exemplo, prófase tarde) identificar um blastômero em um estágio antes da divisão celular (interfase tardio, ou prófase). Marcadores celulares, tais como a posição de centríolos, a iniciação da condensação cromossômica, localização cromossoma ea presença ou ausência do envelope nuclear permitirá identificar estágio do ciclo celular (Figura 2A).
- A câmara é, então, submetido a perfusão com gás azoto (99,999%N 2; <2 ppm de O 2). Neste caso, usamos uma pressão de 6 psi, mas a pressão pode necessitar de ser ajustado e optimizado em função do tamanho de cada microincubator e diâmetro do tubo a ser utilizado. Continuar a monitorizar o blastômero (s) como o azoto enche a câmara, ajustando o plano focal conforme necessário.
- Neste ponto, o lapso de tempo de imagem tiver começado. Formação de imagens é realizada durante o tempo necessário para capturar fenómeno de interesse, neste caso prisão prófase e acoplagem de cromossomas para a membrana nuclear interna. Imagens são tomadas uma vez a cada 10 segundos por não mais do que 30 minutos. Freqüências de captura de imagem e definições, como ganho e potência do laser deve ser ajustada conforme necessário.
- O tempo em que os embriões respondem ao ambiente anóxico pode variar dependendo da fase do ciclo celular após exposição anoxia. Tipicamente anóxia induzida prisão prófase ocorre dentro de 20-30 min a partir do fluxo de gás de azoto. Temos observado anóxia induzida por células ocu parada do ciclorring em <20 min. As imagens podem ser obtidas durante este período de tempo, ou imagens específicas pode ser isolado depois de uma série de lapso de tempo. Uma opção adicional é a utilização de microscopia de vídeo para visualização de estruturas sub-celulares em embriões.
- Para documentar a recuperação do estado de anóxia induzida preso, o gás está desligado ea câmara é permitida para retornar à normóxia por difusão durante a gravação de uma série de lapso de tempo. Reinício da progressão do ciclo celular e desencaixe de cromossomos normalmente ocorre dentro de 5-20 minutos de transformar o gás nitrogênio fora.
- Note-se que em experiências separadas indicador anoxia, resazurina, foi colocado na microcâmara flow-through, determinou-se que a câmara anóxica torna-se, em média, de cerca de 19 min após o fluxo de gás azoto foi iniciada.
- Imagens e vídeos são processadas utilizando Imaris, Imagem J ou Photoshop e importados para o QuickTime para exibição.
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Representative Results
Embriões C. elegans expostas à privação de oxigênio grave (anoxia) são capazes de sobreviver com a prisão de processos biológicos, incluindo desenvolvimento e divisão celular 7. A prisão anóxia induzida da divisão celular pode ser monitorizada, a um nível sub-celular, por meio de uma câmara de microincubation em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratório para criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados in vivo (Figura 1). Estruturas celulares de interesse pode ser monitorado no embrião exposto a ambientes de gás diferentes, neste caso utilizamos GFP-tagged tubulina gama e histona H2B para monitorar a estrutura de cromossomos em um embrião exposto à anóxia.
Dentro do embrião exposto a anoxia, dos cromossomas de blastómeros prófase irá condensar e alinhar com a periferia interna nuclear, um fenómeno designado por "acoplamento cromossoma" (Figura 2, Movie 1).Após a re-oxigenação progressão do ciclo celular será retomada e os cromossomos de blastômeros prófase vai passar da periferia nuclear para a progressão placa equatorial, indicando a metáfase (Filme 2). Esta técnica pode também sido utilizada para visualizar detenção noutras fases da divisão celular ou cromossomos bivalentes de oócitos em hermafroditas expostos a anoxia 8.
Figura 1. Exemplo de microscópio e configuração da câmara utilizada para a análise in vivo. Invertido Zeiss microscópio confocal com Leiden Fechado Perfusion Microincubator e tanque de gás de azoto ligado (A); platina do microscópio e microincubator (B), e vista ampliada de microincubator (C).
Figura 2. HAllmark de anóxia induzida profase preso blastómeros. São mostradas as imagens representativas de um blastômero profase no início do lapso de tempo de imagem (A) blastômero de um embrião exposto à normoxia (B) ou um blastômero de um embrião, após 30 min de exposição a anoxia (C). A prófase anóxia induzida preso cromossomos blastômero exibe ancorados perto da periferia nuclear interna e NEBD é preso. Barra de escala = 5 um.
Filme 1. Lapso de tempo de análise de um blastômero em transição de normóxia anóxia. Observe cromossomas alinhamento para a periferia nuclear. As imagens foram capturadas 28 min depois de fluxo de gás através começou. Clique aqui para ver filme .
Filme 2. Lapso de tempo de análise de um blastômero recuperando de anoxia. Como retornos de oxigênio para o meio ambiente recomeça o ciclo celular. As imagens foram capturadas 10 min após o fluxo de gás através foi cfacilitado. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Privação de oxigênio e Suspended Animation
Embora a exposição à privação de oxigênio grave pode ser fatal para alguns organismos, alguns organismos são capazes de sobreviver à exposição a anoxia. No caso de C. elegans, a sobrevivência de exposição anoxia depende estágio de desenvolvimento e de resposta à anoxia é a entrada para um estado de animação suspensa reversível no qual um certo número de processos biológicos observáveis são presos. Processos de divisão celular, o desenvolvimento, o movimento de comer, e reprodutiva cessar até que o oxigênio é reintroduzido no meio ambiente 7,9. Progressão do ciclo celular, de embriões anoxia-expostas, reversível prisões em interfase, prófase tarde ou metáfase. A utilização de técnicas de biologia das células, tais como a imunocoloração em amostras fixadas e in vivo em ensaios de proteínas de fusão com GFP, o que permite imagens de determinadas estruturas sub-celulares, num ambiente privado de oxigénio, têm sido fundamentais para a identificação e caracterizaçãocaracterísticas específicas de anóxia induzida animação suspensa em C. elegans 8,10,11.
Ambos os embriões e oócitos exibir características marcadas de anóxia induzida animação suspensa que são facilmente visíveis por microscopia de fluorescência, em combinação com as proteínas marcadas com fluorescência ou anticorpos contra as proteínas específicas para analisar embriões fixos. Blastómeros interfase, dos embriões expostos a anoxia, caracterizam-se por condensação parcial de cromatina e paragem da progressão do ciclo celular com um alinhamento cromatina na periferia nuclear 9. Enquanto quebra envelope nuclear (NEBD) significa um compromisso final a mitose em anoxia, prisão prófase caracteriza-se pela prisão de NEBD e alinhamento dos cromossomas condensados totalmente na periferia nuclear 10,12. Prisão metáfase, por outro lado, é caracterizada por prisão dos cromossomas na metafase a placa e despolimerização parcial de microtúbulos, entre outroscoisas. Anóxia induzida por paragem do ciclo celular em todas as etapas é reversível e após reoxigenação, recomeça progressão do ciclo celular. Em exposições anóxia de 24 horas ou menos, os animais controle e experimental são indistinguíveis na recuperação 7. Utilizando os métodos aqui descritos o animal é capaz de sobreviver à exposição anoxia.
Análise de Imagem e Considerações
O método aqui apresentado utiliza o TH32 (unc-119 (ED3) ruIs32 III; ddIs6) estirpe de C. elegans. Esta estirpe expressa duas proteínas marcadas com fluorescência que facilitam a visualização de centrossomas e cromossomas. Centrossomas são marcados por ddIs6 [pie-1-TBG :: 1 :: GFP + unc-119 (+)], que codifica GFP-tagged tubulina gama, e localiza a centrossomas ao longo do ciclo celular. A posição dos centrossomas é indicativa da fase do ciclo celular e é útil em experiências de cronometragem anoxia. Os cromossomas são marcados por ruIs32 [unc-119 (+)-pie :: 1 :: GFP H2B], que codifica uma proteína marcada com GFP histona e é conduzido por um promotor específico de linha germinal 5. Assim, o movimento e localização de cromossomas dentro blastómeros ou oócitos pode ser seguido. Dentro de um embrião em desenvolvimento, antes de anóxia induzida por paragem do ciclo celular, um blastômero, e assim o núcleo, pode mover-se para fora do plano focal tornando-se necessário para ajustar o plano focal enquanto imaging. É possível seguir mais de um núcleo, mas blastômero ou focagem manual no objecto celular de interesse pode ter de ser feito para optimizar a visualização dos vários componentes celulares de interesse. Isso pode limitar a capacidade de automatizar o processo, a menos que a pessoa está usando software para rastrear uma região específica e segui-lo. Nós não tentamos para automatizar o processo.
Para otimizar o protocolo para um de ensaio específico pode-se considerar vários aspectos de microscopia e de fundo genético de interesse 13 (npp-16 (ok1839)) usando a mesma técnica (por exemplo, o mesmo tempo de exposição a anoxia), como controlos, e descobriram que o fenótipo (neste caso prisão anormal dos blastómeros prófase) pode ser capturado dentro de 30 min de exposição a anoxia 10. Os embriões podem sobreviver ao longo de três dias de anoxia usando outras metodologias, não temos conhecimento de mutações que resultam numa resistência à anoxia exposição (sobrevivência estendido além de 3 dias de exposição) no embrião.
Para os nossos propósitos, estamos a imagem de um processo altamente dinâmico celular, e estão usando um microscópio confocal disco giratório para aquisição de imagem rápida. Dependendo das necessidades particulares de uma experiência, que terá de ser determinado se um tipo diferente de técnica de microscopia pode ser mais umappropriate.
Ao escolher ou desenvolver uma estirpe transgénica por este método, é importante ter em conta a sensibilidade do microscópio que vai ser utilizado, bem como a tendência de fotodegradação do fluoróforo particular. A utilização de imagens de lapso de tempo nesta metodologia podem levar a foto branqueamento significativo em estirpes que não expressam fortemente uma proteína fluorescente.
Há vários desafios técnicos e as limitações a serem considerados quando coletando imagens in vivo utilizando esta metodologia. Por causa do tamanho da câmara, e a natureza potencialmente demorado dos experimentos, pode ser difícil de analisar um grande número de amostras num curto período de tempo. Experiências que requerem grandes tamanhos de amostra podem frequentemente ser emparelhado com outros métodos de exposição anoxia para gerar grandes conjuntos de dados, e in vivo de imagem pode ser usada para documentar, verificar ou examinar mais de perto um fenótipo de interesse. Additionally, se a experiência requer um exame em pontos de tempo específicos durante uma exposição a longo termo, problemas com dessecação amostra pode surgir. Apesar de ser coberta com óleo halocarbono, os animais podem começar a secar devido ao fluxo contínuo de gás, por isso limitar o tempo experimental poderia aliviar este problema. Além disso, pode-se considerar a utilização de gás hidratado ou uma câmara, que permite o controlo de humidade para aliviar problemas de dessecação.
Uma vantagem desta técnica é que as experiências de hipóxia são também possíveis. Assim, para os estudos de privação de oxigénio adicional pode-se simplesmente usar um tanque de gás com uma concentração de oxigénio especificado (por exemplo, 1% de O 2 balanceado com N 2) para examinar respostas à hipoxia, em vez de um ambiente completamente anóxico. Além disso, uma outra modificação simples e flexível é o uso de outros gases, incluindo O 2 níveis acima de 21%, H 2 S ou CO, no entanto, a segurança do uso destas misturas de gás é uma major consideração e precauções adicionais devem ser tomadas 14.
Importância da Técnica
Embora tenhamos esboçado esse método para expor C. elegans a anoxia e visualizar marcas de anóxia induzida animação suspensa dentro de um embrião usando muito específicas sub-celulares marcadores, estes resultados são meramente representativas de um único ensaio em uma ampla variedade de possibilidades experimentais utilizando o sistema de câmara de aqui descrita. Privação de oxigénio tem sido demonstrado que afecta um número de processos celulares em uma grande variedade de organismos, e por explorar esta técnica, os efeitos específicos de anoxia, hipoxia, e uma variedade de outros ambientes podem ser visualizados e capturou in vivo. Por exemplo, utilizando-se C. elegans este sistema poderia ser usado para a análise de outros fenótipos induzidos pela privação de oxigénio, tal como permitido com o uso do anestésico tricaina / tetramizole (isto é, da faringe e bombeamento reproductive processos).
A aplicação desta metodologia não está limitado a C. elegans. Este fluxo de gás através da câmara de configuração fornece um método simples para a exposição de células e organismos inteiros a baixas concentrações de oxigénio e simultaneamente capturar as alterações celulares e visualizar a actividade de proteínas de fusão fluorescentes. Por exemplo, este método é facilmente adaptável para leveduras, cultura de células ou de invertebrados pequeno ou embriões de vertebrados cujas dimensões não são muito grandes para a câmara.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de expressar o nosso apreço pela entrada e comentários dos membros do Laboratório de Padilla. Cepas de nematóides neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). Nós reconhecer e agradecer o Dr. Lon Turnbull de assistência técnica com a microscopia confocal. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (NSF-IOS, carreira) para PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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