Summary
Nous décrivons une technique d'enregistrement extracellulaire et stimuler les nerfs, les muscles et les neurones individuels identifiés
Abstract
Multifonctionnalité, la capacité d'une structure périphérique de générer plusieurs comportements distincts, 1, permet aux animaux de s'adapter rapidement leurs comportements à des environnements changeants. Le mollusque marin Aplysia californica fournit un système souple pour l'étude de la multifonctionnalité. Au cours de l'alimentation, l'aplysie génère plusieurs types distincts de comportements en utilisant l'appareil d'alimentation même, la masse buccale. Les ganglions qui contrôlent ces comportements contiennent un certain nombre de grands neurones identifiés qui sont accessibles à l'étude électrophysiologique. L'activité de ces neurones a été décrit dans les programmes moteurs qui peuvent être divisés en deux types, les programmes et ingestifs egestive, basé sur le timing de l'activité neuronale qui ferme la pince par rapport à la nourriture de l'activité neuronale qui prolonge ou se rétracte la pince 2. Toutefois, dans les ganglions isolés, les mouvements musculaires qui produisent ces comportements sont absents, ce qui en faitplus difficile d'être certain que les programmes moteurs observés sont des corrélats des comportements réels. Dans enregistrements in vivo, nerveuses et musculaires ont été obtenus correspondant à des programmes d'alimentation 2,3,4, mais il est très difficile d'enregistrer directement à partir de neurones individuels 5. De plus, in vivo, les programmes ingestifs peut être divisée en morsures et 1,2 hirondelles, une distinction est difficile à faire dans la plupart décrite précédemment préparations in vitro.
La préparation de la masse suspendue buccale (figure 1) comble le fossé entre les noyaux isolés et les animaux intacts. Dans cette préparation, les comportements ingestifs - y compris à la fois mordant et avaler - et des comportements egestive (rejet) peut être obtenue, en même temps que des neurones individuels peuvent être enregistrées et à partir de l'utilisation d'électrodes stimulées extracellulaires 6. Les mouvements d'alimentation associés à ces comportements différents peuvent être enreded, quantifiés et directement liés aux programmes moteurs. Les programmes moteurs dans la préparation de la masse suspendue buccale semblent être plus semblables à ceux observés in vivo que sont les programmes moteurs suscité dans les ganglions isolé. Ainsi, les programmes moteurs de cette préparation peut être plus directement lié au comportement in vivo; dans le même temps, les neurones individuels sont plus accessibles à l'enregistrement et la stimulation que chez les animaux intacts. En outre, comme une étape intermédiaire entre les noyaux isolés et les animaux intacts, les conclusions de la masse suspendue buccale peut faciliter l'interprétation des données obtenues dans des contextes à la fois plus réduites et plus intacte. La préparation de la masse suspendue buccale est un outil utile pour caractériser le contrôle neural de la multifonctionnalité de l'aplysie.
Protocol
1. Préparation des solutions
- À préparer une solution de chlorure de magnésium qui est isotonique à l'eau de mer dans laquelle les animaux sont gardés (~ 1.000 millosmolar), marquer un grand bol au niveau du volume souhaité. Remplissez le pot avec de l'eau distillée à environ 80% de ce niveau, et pesez la quantité appropriée de chlorure de magnésium hexahydraté pour créer une solution de 333 mm dans le volume final. Ajouter le chlorure de magnésium à la cruche, fermer le couvercle et agiter vigoureusement jusqu'à ce que le chlorure de magnésium est complètement dissous, puis ajouter de l'eau distillée jusqu'à ce que le volume final soit atteint.
- Pour préparer une solution saline aplysie, encore une fois marquer un grand pot au niveau du volume désiré, et remplir avec de l'eau distillée à environ 80% de ce niveau. Placez la verseuse sur une plaque d'agitation, placer un barreau aimanté dans le pot, et mettez la plaque d'agitation.
- Un par un, peser et ajouter dans le bol les quantités appropriées des substances suivantes pour créer ces conconcentrations dans le volume final: 460 mM de chlorure de sodium, 10 mM de chlorure de potassium, 22 mM de magnésium hexahydraté, 33 mM de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 mM de calcium dihydrate de chlorure, glucose 10 mM, MOPS 10 mM.
- Une fois que les solutés sont complètement dissous, utiliser un pH-mètre pour mesurer le pH de la solution. Ajouter lentement l'hydroxyde de sodium 1 M pour augmenter le pH jusqu'à une valeur finale de 7,5. Si vous avez accidentellement ajouter de l'hydroxyde de sodium trop, vous pouvez ajouter 1 M d'acide chlorhydrique pour abaisser le pH.
- Ajouter de l'eau distillée jusqu'à ce que le volume final soit atteint.
- Pour ralentir la croissance bactérienne, les solutions de magasin dans le réfrigérateur jusqu'au moment de servir pour une expérience. Notez que la température peut affecter programmes moteurs chez l'aplysie. Nous n'avons pas surveiller attentivement la température, mais une fois l'installation terminée, les préparatifs sont en général près de la température ambiante.
2. Préparation de la vaisselle d'enregistrement
- Pendant l'expérience, la masse buccale sera suspendu en solution dansun rond de 100 mm (diamètre) x 50 mm (hauteur) plat en Pyrex. Ce plat doit avoir une chambre avant de la masse buccale, une étroite plate-forme surélevée où le milieu buccal ganglions sont épinglés sur Sylgard, et une séparée, chambre arrière surélevée où le ganglion cérébral est isolé. Une encoche dans le Sylgard devez connecter la plate-forme ganglions buccale à la chambre ganglion cérébral. Voir la figure 1, se référant aux dimensions spécifiées clés lors de la construction du plat.
- Pour créer ce plat, commencer avec un rond de 100 x 50 mm plat en Pyrex. Préparer Sylgard en suivant les instructions fournies avec le produit. Construction de la parabole, il faudra plusieurs verse de Sylgard, entre lesquels le Sylgard doivent être autorisés à fixer.
- La première coulée est de créer le plus haut niveau de Sylgard dans le plat, le mur entre les chambres buccales et cérébrale (voir la figure 1). Bloquez cette partie de l'assiette des autres sections. Pâte à modeler peut être utilisé pour construiredes parois de blocage de sections. Pour un mur plat, un morceau de carton peuvent être utilisés, avec un support en pâte à modeler. Pour une paroi courbe (ce qui réduit la taille de la chambre contenant le ganglion cérébral), utiliser la pâte à modeler seul comme base de la paroi. Manteau de tous les murs avec de la pellicule plastique où ils seront en contact avec le Sylgard pour faciliter l'enlèvement.
- Une fois l'espace de la paroi entre les chambres postérieures et cérébrale a été bloqué comme décrit dans l'2,3, en veillant à joints étanches au niveau des bords pour minimiser les fuites, verser Sylgard dans cet espace presque jusqu'au sommet de la parabole. Soit l'ensemble Sylgard jour au lendemain, et assurez-vous qu'il est complètement mis en avant de poursuivre. Mettre le plat dans un endroit chaud va induire une prise plus rapide.
- Ensuite, la plate-forme ganglions buccale et la chambre ganglion cérébral doit être versé (encore une fois, reportez-vous à la figure 1, qui montre les emplacements de ces ganglions dans le plat terminé). Retirer les parois antérieures de blocage, et de créer un nouveau mur d'un diposition 0,5 cm de la paroi plane Sylgard de la section médiane de bloquer la plate-forme ganglions buccale. Pas de murs sont nécessaires pour créer la chambre arrière qui tiendra le ganglion cérébral. Verser Sylgard dans les deux sections jusqu'à une hauteur d'environ 3 mm sous le niveau supérieur. La chambre cérébrale doit être légèrement inférieure à la plate-forme de ganglions buccale. Encore une fois, laissez le Sylgard mis du jour au lendemain.
- Enfin, versez la chambre avant (c'est à dire, la chambre dans laquelle la masse buccale sera suspendu). Pas de murs sont nécessaires. Verser à la hauteur appropriée comme indiqué dans la figure 1.
- La dernière étape consiste à faire une entaille reliant la plate-forme ganglions buccale et la chambre cérébrale. La profondeur de l'encoche doit être le même que le niveau de la plate-forme de ganglions buccale. Une lame de scalpel peut être utilisé pour couper l'encoche. Figure 1 illustre le plat terminé.
3. Préparation des électrodes
- Tirez e extracellulairelectrodes du seul canon capillaire en verre à l'aide d'une micropipette Flaming-Brown extracteur. Diamètres intérieurs des électrodes doit être d'environ 40 um et leurs résistances devraient être d'environ 0,1 MQ. Avec le filament FT345B dans l'extracteur, nos typiques sont les paramètres du programme extracteur de chaleur 480, Pull 50, Vel 13, et de l'heure 20, mais notez que les paramètres seront différents pour différents filaments. Ce programme crée des électrodes en un seul geste sans étape poli-feu. Avant de commencer l'expérience, les électrodes extracellulaires remblai avec une solution saline aplysie.
- Créer électrodes crochet pour les nerfs et les muscles d'enregistrement 2 à la suite d'un protocole similaire à celui décrit par Cullins et Chiel 4, sauf que les électrodes individuelles n'ont pas à être enroulée autour de l'autre. Les étapes pour créer ces électrodes suivre 03.03 à 03.13.
- Coupez un morceau de émaillé, 0,001 diamètre du fil d'acier inoxydable pouces pour une longueur d'environ 60 cm. Fixer une boule de pâte à modelerà chaque extrémité du fil, tenir le fil en l'air en son milieu, et faire tourner les deux boules d'argile autour de l'autre pour envelopper les fils autour de l'autre (ce qui réduit les transitoires capacitifs).
- Maintenir les deux extrémités du fil ensemble en joignant les deux boules d'argile en une balle, et l'autre extrémité de bande de la toile de suspendre le fil.
- Manteau toute la longueur de fil dans la colle silicone ménages en plaçant une boule de colle sur le pouce, en touchant le pouce et l'index ensemble sur le fil, et les faire fonctionner sur le réseau. Laissez la colle sécher pendant la nuit.
- Après que la colle sèche, placer le fil sur une surface plane sous un microscope binoculaire de dissection. Couper l'extrémité du fil qui a été précédemment le milieu, ce qui entraîne deux fils séparés enroulés ensemble. Il s'agit d'une électrode différentielle.
- Utilisez du ruban adhésif pour maintenir l'une des extrémités de l'électrode en place. En utilisant une pince à dénuder colle et l'émail, préparer les deux fils à une extrémité pour avoir environ 2 cm of fil gratuit avec environ 1 cm de la partie dénudée de l'émail. Une broche de connecteur de soudure or à chacun des fils, et la bande de laboratoire place autour des broches de les maintenir séparés.
- À l'autre extrémité de l'électrode, de préparer les fils d'avoir environ 3 mm de fil libre. Enlever l'émail des environ 1 mm derniers d'un fil, et ce fil se pencher en arrière et hors de la voie. C'est le fil de référence. Il est essentiel que les deux fils n'ont pas de fil nu en contact entre eux.
- Enlever l'émail de l'autre fil tout le chemin à la colle silicone. Tordre ce fil en forme de crochet et le couper à une longueur d'environ 1 mm. Ce crochet joindre au nerf ou de muscle. À l'aide d'un crochet court permet une plus grande stabilité lorsque le nerf est fixé à l'électrode.
- Utiliser un multimètre pour vérifier que l'électrode est correctement construit et intact. Un connecteur or doit avoir une valeur de résistance d'environ 200-500 ohms par rapport à l'extrémité d'un fil, et l'autre or connecterou devrait avoir une lecture similaire par rapport à l'autre fil.
- S'il n'y a pas une liaison intacte sur un fil, il peut être possible de re-dénuder l'extrémité du fil et faire une soudure une ou deux connecteurs d'or pour créer ces liens. Si les deux connecteurs dorés ont des liens avec les deux fils, l'électrode peut avoir deux fils dénudés en contact. Il peut être possible de fixer l'autre extrémité pour éliminer ce problème, sinon, l'électrode doit être jeté.
- Répétez cette procédure pour autant d'électrodes qui sont nécessaires pour l'expérience. Électrodes crochets peuvent être réutilisés d'une expérience à en coupant l'extrémité attachée au nerf et la création de nouveaux crochets, jusqu'à ce que le fil devient trop court après plusieurs utilisations. Chaque fois que cela est fait, utiliser le multimètre pour vérifier que l'électrode est intacte.
- Pour garder une trace des différentes électrodes au cours des expériences, des électrodes d'étiquettes et de leurs câbles. En utilisant différentes couleurs de ruban de laboratoire sont utiles.
- Choisissez un animal sain d'environ 200-300 g de poids. Lorsqu'ils sont présentés avec les algues, l'animal doit produire des piqûres avec protractions fortes à intervalles réguliers de 3-5 sec.
- Placer l'animal dans un bac de dissection et anesthésier par injection environ 50% du poids corporel solution isotonique de chlorure de magnésium. Faire la première injection avec la seringue à environ un angle de 15 à 30 degrés, vers le milieu et en direction de la queue de l'animal. Après l'injection, masser doucement la surface de l'animal à se répandre sur le chlorure de magnésium. Faire des injections supplémentaires au besoin avec la seringue dirigée vers la tête de l'animal.
- Après que l'animal cesse de répondre aux stimuli tactiles doux, épingler l'animal sur le plateau, face dorsale en place, avec une broche dans la queue et une broche dans chaque tentacule antérieure.
- Utilisez une pince pour pincer et soulever la peau de l'animal dans le milieu de la tête, derrière les rhinophores. Make une incision coronale à travers la tête de l'animal, juste derrière le point d'être tenue. Ensuite, faire une incision sagittale médiane à l'avenir entre les rhinophores vers la bouche, exposant la masse buccale.
- Utilisez une pince pour retirer le lambeau de peau plus près de vous éloigner de la masse buccale, et couper à travers les nerfs et le tissu conjonctif qui se fixent à la paroi du corps de séparer complètement de ce lambeau de peau à partir de la masse buccale. Veillez à ne pas couper les nerfs ou les tissus intrinsèque à la masse buccale.
- Utilisez une pince pour saisir et tenir l'œsophage. Couper à travers la partie postérieure œsophage au point d'être tenue. Tirez sur l'œsophage de soulever la masse buccale comme les coupes suivantes sont faites.
- Derrière la masse buccale, le cerveau, la plèvre, et forme un cycle de pédale noyaux, avec le ganglion cérébral attaché aux noyaux buccale par les connecteurs cérébro-buccaux (CBC). Laisser ces ganglions anneau fixé à la masse buccale, et couper tous les nerfs saillants de ces ganglions à d'autres partiesle corps.
- Couper à travers les tissus conjonctifs autour de la masse buccale, en continuant à soulever la masse buccale jusqu'à car il devient moins relié au corps. Une fois que la masse buccale est seulement attachée à la bouche, l'œsophage et de la masse buccale doit être tenu à la verticale.
- Effectuer une coupe finale juste en avant de la mâchoire à libérer la masse buccale du corps. Placer la masse buccale à une solution de 50% solution isotonique de chlorure de magnésium et 50% de solution saline aplysie, afin de maintenir l'anesthésie partielle tandis que des électrodes sont fixées.
- Placez la masse buccale, avec une solution, dans une boîte de Pétri à fond Sylgard. Retirer les ganglions pleural et pédale en coupant leurs liens avec le ganglion cérébral. Laissez le ganglion cérébral attachés aux noyaux vestibulaires et la masse buccale via les connecteurs cérébro-buccaux (CBC), couper les autres connexions entre le ganglion cérébral et de la masse buccale. Coupez l'œsophage et les glandes salivaires de courtes longueurs de sorte qu'ils n'ont pas get de la manière.
5. Fixation des électrodes crochet
- Pour l'enregistrement et la stimulation, des électrodes à crochets peut être attaché à un certain nombre de différents nerfs et des muscles, en fonction de l'expérience (Figure 2).
- Pour caractériser les modes comme l'a démontré in vivo par Cullins et Chiel 4, fixer des électrodes sur le nerf, le muscle radular I2, et les nerfs buccaux 2 et 3. Ensemble, ces enregistrements montrent l'activité des neurones moteurs pour les principaux muscles intrinsèques de la masse buccale 3,7,8, et permettre l'identification de la phase de prolongation de l'enregistrement I2 3, la phase de rétraction des nerfs buccaux 2 et 3 enregistrements 2 , 5,8, et le moment de la fermeture de la pince nourriture du 2 Enregistrement nerf radular. Fixer une électrode crochet supplémentaire pour brancher un des 2 Nerf vestibulaire à la stimulation pattern. La fixation des électrodes suit une procédure similaire à celle DÉMONSTRATIONed par Cullins et Chiel 4, et il est décrit dans les étapes suivantes.
- Pour chaque électrode de fixation, placer l'électrode sur un manipulateur grossier. Pour le manipulateur, l'adhésif un morceau de bois avec une pince crocodile sur son extrémité et en utilisant la pince pour saisir l'extrémité de l'électrode. La séquence doit joindre à la section revêtu de silicone de l'électrode, d'environ 1 cm avant la fin de la couche de silicone. Utiliser le manipulateur pour positionner l'électrode de crochet à proximité de la masse buccale.
- Avec la masse buccale sur le côté et placé contre le côté de la boîte pour la stabilité, commencer par le nerf radular, qui présente la fixation d'électrode la plus difficile. Il ya deux options pour accéder à ce nerf.
- Les projets nerveuses radular par le dessous du ganglion vestibulaire et passe sous le muscle I2 en deux branches. Tout d'abord, voir si le nerf radular peut être consulté sans couper le muscle. Poussez doucement de côté la gaine blanche fixer les ganglions buccale au muscle I2; do pas couper cette gaine. Si le nerf est accessible, utilisez une pince à l'extrémité recourbée en crochet pour soulever une branche du nerf.
- Si le nerf radular n'est pas accessible de cette manière, une seconde option est de localiser le nerf sous le mince I2 musculaire, et de faire une petite incision dans I2 à exposer le nerf. Cette incision doit passer par deux couches de muscles. Utiliser la pince à crochet pour tirer une branche du nerf radular de dessous du muscle.
- Utilisez le manipulateur à la position de l'électrode crochet à côté du nerf. Pour placer le nerf dans le crochet, il est utile de tenir le nerf de la pince à crochet tout en utilisant simultanément une autre paire de pinces pour créer une séparation entre les deux moitiés du nerf détenu.
- Après le nerf est bien dans le crochet, utilisez le manipulateur pour soulever le nerf loin de la masse buccale jusqu'à ce qu'elle soit tendue, mais ne pas forcer.
- Prenez un Kimwipe et bien tordre un coin pour former une petite mèche. Utilisez cette mèche pour sécher leextrémité de l'électrode et la section de nerf qui est accroché.
- Utilisez une autre série de courbes à pointe pince à appliquer une boule de gel colle rapide super pour le nerf crochu. Commencer l'application au niveau du point de contact entre le fil et le nerf. Faire en sorte que le crochet est entièrement recouverte de colle, et en ce que l'extrémité du fil de référence n'est pas recouverte de colle (figure 3).
- Utiliser une seringue avec une fixation des tuyaux en polyéthylène à appliquer une solution de la colle sur le plat, ce qui va entraîner la surface de la colle durcir. Assurez-vous de bien se laver la colle avec une solution afin de s'assurer que la colle prenne correctement.
- Utilisez le manipulateur pour relâcher la tension sur le nerf, puis relâchez l'électrode de la pince. Ceci termine la procédure de fixation d'une électrode crochet.
- L'électrode I2 muscle doit être fixé suivant. Nous enregistrons l'activité EMG du muscle I2 plutôt que l'activité ENG de son nerf innervant parce que le nerf I2 est très small et difficiles d'accès dans une masse intacte buccale. Près de nerf buccal 2, utilisez la pince à crochet pour soulever une ou deux bandes du muscle I2, et utiliser une autre paire de pinces pour les aider à se séparer du reste du muscle. La partie de I2 séparé devrait être similaire en épaisseur du nerf vestibulaire 2 ou 3. Attention à ne pas trop séparée (qui peut denervate le muscle). Fixer une électrode de crochet avec la même procédure que pour le nerf radular.
- L'électrode prochaine pour fixer, c'est que pour la branche d'un de nerf buccal 2. Cette branche peut être stimulé électriquement pour induire programmes moteurs 9. Avant de nerf buccal 2 va sous le muscle I1 à la rainure latérale, le nerf trifurcates; une branche est la première branche de se séparer. Les branches sont assez petites, de sorte que la fixation d'électrode doit être fait avec soin. Suivez la même procédure pour fixer l'électrode.
- Nerfs buccaux 2 et 3 sont facilement accessibles. Suivez la même procédure, fixer l'électiontrodes à peu près à mi-chemin entre le ganglion vestibulaire et rainure latérale.
- Pour aider à distinguer les neurones avec des projections unilatérales contre bilatérale, il est également utile de fixer des électrodes sur les nerfs buccaux 2 et 3 de l'autre côté de la masse buccale, ainsi que buccale du nerf 2 branche a, parce que certains neurones réagissent différemment à vs ipsilatérale . controlatérale BN2-stimulation.
6. Positionnement du ganglion et l'amincissement de la gaine
- La masse buccale sera déplacé vers le rond de 100 x 50 mm plat en pyrex décrit dans la section 2. Voir la figure 1.
- Appliquez une fine couche de graisse à vide à l'encoche entre les chambres cérébraux et buccale, à l'aide d'une pointe de pipette pour ramasser une boule de graisse à vide et l'étaler sur l'encoche. Nous avons découvert que la graisse à vide minimise les fuites mieux que la vaseline. Remplir la chambre avant avec une solution saline aplysie. Déplacez doucement la masse buccale de la boîte de Pétri pour la chamb avanter de cette parabole plus grande, en s'assurant qu'aucun des électrodes sont bien tirés, ce qui pourrait briser les nerfs.
- Si le plat doit être transféré à un autre microscope binoculaire de dissection pour éclaircir la gaine, être très prudent avec les électrodes crochet. Le groupe des électrodes sur un côté de la masse buccale ensemble, ainsi que les électrodes du groupe de l'autre côté de la masse buccale ensemble. Soigneusement maintenir les électrodes en saisissant la bande de laboratoire qui recouvre les broches du connecteur, à nouveau en s'assurant qu'aucun des électrodes sont tirés fermement.
- Quand le plat est placé sous le microscope, les électrodes doivent être drapé doucement sur les côtés du plat et reposent sur la plate-forme à côté du plat.
- Pendant les pauses et entre les étapes de l'expérience, il faut aérer la solution saline dans la chambre de masse buccale à l'aide d'une pierre à air d'aquarium.
- Pin le ganglion cérébral à l'arrière avec les connecteurs cérébro-buccaux (CBC) en cours d'exécution à travers l'encoche. Appliquer g plus de videRease au cours des CBCs, puis ajouter une solution saline plus aplysie aux deux parties de l'antenne, donc les noyaux sont complètement submergées. Faire en sorte que la quantité de graisse à vide est ajoutée élevé que le niveau de solution saline dans les chambres soit cérébraux ou buccale pour qu'aucune fuite ne se produit entre les chambres. A ce stade, la masse buccale doit reposer sur le fond de la chambre avant de façon à ne pas tirer trop fort sur les nerfs et les ganglions.
- Pin les ganglions buccaux sur la plate-forme du milieu. Pour éviter d'endommager les nerfs qui sont encore attachés à la masse buccale, le seul endroit broches sur la gaine entre deux nerfs. Ajouter deux broches plus sur le côté des CBCs à s'étirer et à ancrer eux.
- Maintenir la plate ganglions buccale ou une rotation sur la base de l'emplacement des neurones d'intérêt. Pour faire pivoter le ganglion vestibulaire, utilisez une pince fine pour saisir une gaine en excès de la SRC et la broche vers le bas entre les nerfs buccaux 2 et 3. Ensuite, la plupart des corps cellulaires qui sont à proximité de la chambre arrière et ne peut pas être easily accessible à partir de la partie supérieure du ganglion buccal peut être vu. Enfin, ajouter deux repères sur la gaine du ganglion buccal à proximité de la face vestibulaire de masse afin de minimiser le déplacement du ganglion buccal. Voir la Figure 4.
- Utilisez une pince fine pour saisir la gaine du ganglion vestibulaire à proximité de la chambre arrière, puis couper la gaine supérieure avec des ciseaux fins, sans exposer les corps cellulaires. Afin de minimiser les dommages, ne retirez la quantité de gaine nécessaire pour voir les corps cellulaires.
7. Stimulation et d'enregistrement
- Après amincissement de la gaine est terminé, fixez toutes les broches d'électrodes à leurs prises sur les câbles qui relient les amplificateurs. Encore une fois, assurez-vous que les électrodes ne sont pas bien tiré pendant cette opération. Assurez-vous que les électrodes sont bien attachés à leurs câbles appropriés et que les polarités sont correctes.
- Pour laver toute chlorure de magnésium restant, remplacer le Aplysiune solution saline dans la chambre de masse buccale avec une solution saline aplysie frais.
- Enfiler un fil de suture en soie à travers le tissu mou à l'avant de la masse buccale, antérodorsale au cartilage de la mâchoire, et d'utiliser deux morceaux de pâte à modeler pour fixer la suture sur le bord de la cuvette, suspendant ainsi la masse buccale de son extrémité antérieure. Noter que l'extrémité postérieure est suspendu par les nerfs vestibulaires liés aux noyaux buccale.
- Positionner un manipulateur de maintien d'une électrode en verre extra-cellulaire de telle sorte que la pointe de l'électrode est proche du ganglion buccal.
- Pour localiser et identifier un neurone, utilisez le manipulateur pour appuyer légèrement sur la pointe de l'électrode extracellulaire vers le bas sur la gaine sur le soma des neurones (Figure 5). Appliquer un courant de stimulation, puis changer le canal qui est utilisé pour exciter le soma en mode d'enregistrement afin d'enregistrer l'activité sur l'électrode extracellulaire et l'activité correspondante sur les nerfs (figure 6). Référeraux cartes ganglionnaires et de description des neurones, y compris les projections nerveuses et musculaires, innervations (par exemple 7,8) pour aider à l'identification des neurones.
- Pour l'enregistrement vidéo des programmes d'alimentation, la position d'un miroir sur le côté du plat, afin que des vues de face et de côté de la masse buccale peuvent être vus simultanément (emplacement du miroir est schématisé sur la figure 1). Placez une caméra vidéo à l'avant et de côté dans son champ de vision.
- Les enregistrements vidéo et électrophysiologiques peuvent être synchronisés en envoyant une impulsion TTL à la fois à une minuterie électronique en vue de la caméra et à un canal dans AxoGraph, le programme informatique utilisé pour enregistrer et analyser les données électrophysiologiques. Cette impulsion fournit un point dans le temps qui est exactement le même dans les enregistrements AxoGraph et vidéo, sur la base duquel les fichiers peuvent être synchronisés.
- Après un neurone est situé, son activité peut être enregistrée dans l'alimentation des différents comportements similaires, qui can être obtenue comme décrit ci-dessous.
- Pour induire un rejet de type programmes moteurs, de stimuler BN2-un. Avec une longue traîne de 2 Hz, 1 ms impulsions 9 (notre expérience est que cette stimulation génère de manière fiable les modèles egestive dans ce cadre) Motifs maintenue pour la durée de la stimulation et peuvent se poursuivre jusqu'à peu de temps après la stimulation se termine.
- Pour inciter les programmes moteurs d'agressivité comme 12, placer quelques cristaux de carbachol solide directement sur le ganglion cérébral. Par ailleurs, si un niveau contrôlé de l'exposition carbachol est nécessaire, utiliser une solution comprise entre 1 et 10 mM de carbachol chez l'aplysie saline. Des concentrations plus élevées sont plus susceptibles de donner des réponses. Motifs répétitifs commencent généralement à moins de 5 min, et le dernier pour environ 10 à 15 min avant de commencer à courir vers le bas.
- Pour faire ingérer-comme 13 programmes moteurs, appliquer le carbachol, et attendre jusqu'à ce que la masse buccale génère de fortes morsures. Puis, lors d'une piqûre, placez une banded'algues (algues séchées) dans la bouche de l'animal de telle sorte que la radula saisit les algues (figure 7). Les bandes sont généralement de 0,5 cm de large par 5 cm de longueur.
- Après la première série de carbachol induites par les modèles, il est souvent possible d'obtenir des réponses supplémentaires carbachol. Laver soigneusement la solution saline aplysie dans la chambre ganglion cérébral, l'enlèvement et le remplacement de la solution saline au moins trois fois. Attendez au moins 20 minutes avant d'appliquer à nouveau le carbachol. Attendre jusqu'à 40 minutes peuvent donner des résultats plus fiables.
A cette époque aux États-Unis, les animaux invertébrés ne nécessitent pas l'approbation officielle par une utilisation des animaux des établissements et du comité des soins. Cependant, nous avons veillé à ce que tous les traitements de l'aplysie minimiser les dommages et de souffrances à l'animal, et que toutes les dissections sont faites alors que l'animal est complètement anesthésié.
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Discussion
Des travaux antérieurs ont caractérisé l'aplysie programmes moteurs chez l'animal intact et dans la préparation réduits, tels que les ganglions isolé. Chez l'animal intact, bien que des enregistrements de neurones individuels ont été obtenus 5, de telles expériences sont très difficiles, et les électrodes ne peut pas être déplacé d'un neurone à pendant l'alimentation. Dans les ganglions isolés, les mouvements alimentation induites par l'activité neuronale peut pas être observée. La préparation de la masse suspendue buccale comble le fossé entre ces deux extrêmes.
Autres préparations semi-intactes ont été utilisées dans des études précédentes, mais la préparation de la masse suspendue buccale présente des avantages importants. Dans une préparation semi-intact, les lèvres et la masse buccale sont encore attaché, mais la préparation est trop réduite pour les mouvements d'alimentation complètes à observer 14. Une préparation tête d'alimentation 15,16 observation a permis de nourrir les mouvements in vitro. Cependant, ese nourrit de préparation tête était plus compliqué à mettre en place que la masse suspendue orale décrit ici, et seulement donné accès à des neurones individuels dans le ganglion cérébral, et non dans le ganglion vestibulaire. Il ya un avantage à la préparation tête d'alimentation, en ce que la présence de la bouche et les tentacules antérieure a permis la génération de modèles qui piquent à travers un stimulus naturel, application d'algues. Bien que cela rendrait l'expérience plus difficile, il peut être possible de combiner les préparatifs, laissant les lèvres attachées à la masse buccale, tout en épinglant les ganglions buccaux pour l'accès aux neurones individuels.
Habitudes alimentaires chez l'aplysie peut être classée comme l'ingestion ou egestive fonction de la date de l'activité sur le nerf radular, qui ferme la pince alimentaire, par rapport à la prolongation et les phases de rétraction des programmes moteurs. Si l'activité nerveuse radular se produit en même temps que la phase de rétraction, les modèles sont ingestive, parce que la pince se referme et se rétracter lorsqu'il tente de tirer des aliments dans la cavité buccale. Si l'activité nerveuse radular se produit pendant la phase de prolongation, les modèles sont egestive, parce que la pince se referme et prolongeant pour pousser le matériau hors de la cavité buccale 2.
Modèles ingestifs peut être divisé en au moins deux sous-types distincts: piqueurs, tente de saisir la nourriture, et de la déglutition, le transport de la nourriture 1,2 déjà compris. Cependant, dans la plupart des travaux in vitro (par exemple 14,17,18) a mis l'accent uniquement sur la dichotomie ingestion / égestion, ne cherche pas à distinguer les morsures d'avaler. Deux études 16,19 ont classé dans les modèles in vitro ingestifs dans des groupes d'agressivité et de la déglutition comme comparables. Dans la première de ces études, les tendances ont été observées dans les ganglions isolé, si les mouvements d'alimentation associés de la masse buccale peut être observée, cela renforce l'argument selon lequel lamotifs soi représenter le mordant et la déglutition observés in vivo. Dans la seconde étude, les tendances ont été observées dans une préparation tête d'alimentation, de sorte modèles ont été classés en fonction des mouvements observés, mais pas des enregistrements de neurones ganglionnaires vestibulaires ont été obtenus.
La préparation de la masse suspendue buccale fournit un moyen d'observer les trois types de comportements - mordre, de la déglutition et de rejet - tout en enregistrant simultanément l'activité de nerfs buccaux clés et les muscles, et à la fois stimulant et l'enregistrement des neurones individuels. La technique neurone extracellulaire 6 est une autre avancée majeure dans cette préparation, parce que les fortes alimentation de type mouvements suscité serait presque certainement déloger une électrode intracellulaire. Avec les enregistrements extracellulaires de neurones individuels, le moment de l'activité de ces neurones au cours de programmes moteurs peut être établi lorsque ce serait difficile avec des enregistrements nerveuses seul, parce que de nombreuses unités différentes sont fiRING simultanément.
Nous avons observé que les mouvements d'alimentation dans la masse suspendue buccale apparaissent qualitativement similaires à ceux observés in vivo. Surtout, les stimuli utilisés pour générer des modèles de piqueurs et de rejet (carbachol et buccale du nerf 2 branches de stimulation, respectivement) ont été utilisées dans des préparations plus réduites, et notre constatation selon laquelle les stimuli générer des mouvements physiologiques donne de la crédibilité à leur utilisation dans d'autres contextes. En revanche, pour générer des motifs de déglutition, nous avons combiné un stimulus artificiel (carbachol) avec un stimulus alimentaire naturel (une bande d'algues) qui ne pouvait pas être appliquée aux ganglions isolé. Nous avons également observé que les configurations neuronales dans la masse suspendue buccale semblent être plus semblable à des modes in vivo que ne le sont les modèles obtenus dans des préparations plus réduites, ce qui suggère la rétroaction sensorielle peut être important dans l'élaboration des schémas de la CPG. Par exemple, les moteurs des programmes en bande isoléelia sont généralement plusieurs fois plus longue durée que les programmes moteurs chez les animaux intacts, tandis que les programmes à moteur dans la masse suspendue buccale sont généralement beaucoup plus proche dans le temps à des programmes moteurs chez les animaux intacts (données non publiées). Un autre avantage de la masse suspendue buccale est que côté simultanée des vues de face et de l'appareil d'alimentation peut être obtenue. La vue de face fournit une vue similaire de la bouche de celui qui serait observés in vivo, tout en permettant une meilleure observation de la contraction musculaire de la mâchoire. La vue latérale permet l'observation des contractions musculaires buccaux et le mouvement vers l'avant et vers l'arrière de la pince sous les muscles, ce qui rend plus facile de comprendre les changements biomécaniques au cours des comportements différents.
Dans cette préparation, nous avons enregistré d'un maximum de cinq nerfs (nerfs radular et bilatéraux nerfs buccaux 2 et 3) et le muscle I2 simultanément, et placé à deux électrodes extracellulaires plus identifiéles cellules nerveuses du ganglion. Il serait possible d'enregistrer des nerfs supplémentaires et / ou des muscles, si l'expérimentateur désiré. Il serait également possible de stimuler et enregistrer à partir de neurones dans le ganglion cérébral, ce qui pourrait donner un aperçu si la stimulation cérébrale des interneurones buccales, une technique courante 17,19, induit programmes moteurs similaires à comportement in vivo. Bien que faisant accroît la difficulté technique de la préparation, de la perfusion de l'artère buccale 15 pourrait permettre la préparation de générer des comportements plus fortes et plus durables (observations non publiées).
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le NIH et la NSF subvention NS047073 subvention DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
