Summary
我々は細胞外記録し、神経、筋肉、および個々の識別されたニューロンから刺激するテクニックを説明
Abstract
多機能、複数の、そして、異なった行動を生成するには1つの周辺構造の能力は、動物が急速に変化する環境に自分の行動を適応することができます。海洋軟体動物アメフラシカリフォルニは多面的機能の研究のための扱いやすいシステムを提供します。授乳中は、 アメフラシは同じ送り装置、頬質量を用いて行動のいくつかの異なったタイプを生成します。これらの行動を制御する神経節の電気生理学的研究からアクセス可能な、大規模で識別されたニューロンの数を含んでいます。これらのニューロンの活性がprotracts縮みグラスパー2その神経活動に対する相対食品グラスパーを閉じ神経活動のタイミングに基づいて2種類、ingestiveとegestiveプログラム、に分けることができ、モータのプログラムに記載されている。しかし、単離された神経節で、これらの行動を生み出すであろう筋肉の動きは、それを作って、欠席している観測されたモータのプログラムは、実際の行動の相関があるかどうか。 生体 、神経と筋肉のレコーディングでは、特定することが難しいが2,3,4給餌プログラムに対応して得られますが、それは直接個々のニューロン5から録音することは非常に困難であるされています。さらに、in vivoで 、ingestiveプログラムは、さらに刺され、ツバメの1,2、最も以前にin vitro標本で説明で行うことが困難である区別に分けることができます。
中断頬大量調製（ 図1）は、孤立した核と無傷の動物の間のギャップを埋めます。この準備として、ingestive行動-かむと嚥下の両方を含む-とegestive行動（拒否）は、個々の神経細胞は、細胞外から記録電極6を使用して刺激することができると同時に、誘発することができます。これらの異なる動作に関連付けられている餌の動きがrecorすることができますDEDに、定量化、およびモータのプログラムに直接関係する。中断頬大量調製におけるモータープログラムは孤立核において誘発運動プログラムよりもin vivoで観察されたものにもっと似ているように見える。したがって、この準備のモータのプログラムは、より直接的に生体内挙動にに関連することができます。同時に、個々の神経細胞は無傷の動物よりも記録と刺激によりアクセス可能です。また、孤立した核と無傷の動物との間に中間のステップとして、中断頬塊から得られた知見は、より減少し、より完全な両方の設定で得られたデータの解釈を助けることができます。中断頬マスの準備はアメフラシにおける多面的機能の神経制御を特徴づけるための便利なツールです。
Protocol
1。溶液の調製
- 動物が置かれている海水（〜1,000 millosmolar）に等張性である塩化マグネシウム溶液を調製するためには、目的のボリュームのレベルで大きな水差しをマーク。このレベルの約80％を蒸留水で水差しを記入し、最終体積333 mM溶液を作成するために塩化マグネシウム六水和物の適切な量を量る。水差しに塩化マグネシウムを追加して、蓋を閉じて、塩化マグネシウムが完全に溶解するまで激しく振り混ぜた後、最終体積に達するまで蒸留水を追加します。
- アメフラシの生理食塩水を準備するには、もう一度目的のボリュームのレベルで大きな水差しをマークし、このレベルの約80％に蒸留水を満たします。撹拌プレート上水差しを置き、水差しに攪拌棒を置き、攪拌プレートの電源をオンにします。
- ひとつずつ、これらの詐欺を作成するには以下の物質の適切な量を秤量し、水差しに追加最終体積centrations：460 mM塩化ナトリウム、10mMの塩化カリウム、22 mMの塩化マグネシウム六水和物、33 mMの硫酸マグネシウム七水和物、10mMの塩化カルシウム二水和物、10mMグルコース、10mMのMOPS。
- 溶質が完全に溶解したら、溶液のpHを測定するpH計を使用しています。ゆっくりと7.5の最終値にpHを上げるために1 M水酸化ナトリウムを加える。あなたが誤ってあまりにも多くの水酸化ナトリウムを追加する場合は、pHを下げるために1 M塩酸を追加することができます。
- 最終容量に達するまで蒸留水を追加します。
- 実験のために必要になるまで、細菌の増殖を遅らせるために、冷蔵庫でソリューションを格納します。温度はアメフラシモータープログラムに影響を与える可能性があることに注意してください。我々は慎重に温度を監視しませんが、セットアップ完了後、準備が一般的に室温付近である。
2。録音皿の調製
- 実験中、頬の質量が溶液中に中断されラウンド100ミリメートル（直径）×50 mm（高さ）パイレックス皿。この皿は頬マス、頬神経がシルガード上で固定される狭い、高架ミドルプラットフォーム、および脳神経節が分離されて独立した、高架裏面室用前室を持つ必要があります。シルガードのノッチは、大脳の神経チャンバーに頬神経プラットフォームを接続する必要があります。皿を構築するときに指定したキーの寸法を参照して、 図1を参照してください。
- この料理を作成するには、ラウンド100×50mmのパイレックス皿で始まります。製品に付属の指示に従って、シルガード準備します。皿の建設がいくつかはシルガードが設定できるようにする必要があり、その間、シルガードを注ぐ必要があります。
- 第一流動は皿の中シルガード最高レベルの、口腔内および脳室（ 図1を参照）との間に壁を作成することです。他のセクションから皿のこの部分を遮断する。粘土を構築するために使用できますセクションを遮断するための壁。平らな壁には、ボール紙を粘土のバッキングで、使用することができます。湾曲した壁（脳神経節を含むチャンバーのサイズが縮小されている）については、壁の基礎として単独で粘土を使用しています。ラップでコートはすべての壁は簡単に除去するためのシルガードご連絡させていただきます。
- 2.3で説明したように一度頬や脳室の間の壁のためのスペースはほぼアップ皿の上部にこの空間にSYLGARD注ぎ、漏れを最小限に抑えるためにエッジでタイトなシールを確保し、遮断されています。一夜シルガードセットしましょう、それは完全に続行する前に設定されていることを確認してください。暖かい場所で皿を置くと、より速く設定を誘導します。
- 次に、頬神経プラットフォームと脳神経節室（もう一度、 図1を参照して、完成した皿の中で、これらの神経節の位置を示している）注がれるべきである。以前の遮光壁を取り外し、新しい壁ジを作成頬神経プラットフォームを遮断するための中間セクションのフラットシルガード壁から0.5cmのスタンス。いいえ壁は脳の神経節を保持するバックチャンバーを作成する必要がありません。トップレベルの下約3mmの高さに両方のセクションでシルガードを注ぐ。脳室は頬神経のプラットフォームよりもわずかに低くする必要があります。再び、シルガード、一晩に設定しましょう。
- 最後に、前室（ すなわち 、頬質量が中断されたチャンバ）を注ぐ。いいえ壁は必要ありません。 図1で指定されるように適切な高さまで注ぐ。
- 最後のステップは、頬神経プラットフォームおよび脳室を結ぶノッチをカットすることです。ノッチの深さは頬神経プラットフォームのレベルと同じでなければなりません。メスの刃、ノッチをカットするために使用することができます。 図1は完了皿を示しています。
3。電極の作製
- 細胞外の電子を引っ張るフレイミング·ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、単一の銃身のガラスキャピラリーからlectrodes。電極 '内径は約40μmであるべきであり、彼らの抵抗は約0.1MΩでなければなりません。プラーでFT345Bフィラメントにより、当社の代表的なプラープログラムの設定は、ヒート480、プル50、ヴェル13、時間20であるが、設定が異なるフィラメントに対して異なるであろうことに注意してください。このプログラムではありません火研磨ステージとシングルプルで電極を作成します。実験を始める前に、 アメフラシの生理食塩水で細胞外電極を埋め戻す。
- その個々の電極がお互いの周りをラップする必要がない場合を除き、Cullinsとチール4で説明したのと同様のプロトコールに従って、2神経と筋肉の録音のためにフック電極を作成します。これらの電極を作成する手順は、3.3から3.13に従う。
- 約60cmの長さにエナメルコーティングされた、0.001インチ径のステンレス鋼線の部分をカットします。粘土のボールを取り付けワイヤーの両端には、その中間地点で空気中でワイヤーを保持し、互いに周りにワイヤーをラップするためにお互いの周りを粘土の二つのボールをスピンさせます（これは容量のトランジェントを減少します）。
- 1ボールに粘土の二つのボールを接合することによって一緒にワイヤーの両端を持ち、テープ線材を中断する線のもう一方の端。
- 、親指に接着剤の塊を配置するワイヤ上で一緒に親指と人差し指を触れて、ワイヤの上にそれらを実行することにより、家庭用シリコーン接着剤でコートワイヤーの全体の長さを。接着剤は一晩乾かします。
- 接着剤が乾燥した後、双眼実体顕微鏡下で平らな面に線を配置します。撚り合わせた2つの別々の電線で、その結果、以前に真っ只中であったワイヤの端をカットします。これは、差動電極である。
- 代わりに電極の一方の端部を保持するためにテープを使用してください。約2cm Oを持っている一端に両方のワイヤを準備し、接着剤やエナメルをはがすためにピンセットを用いてエナメル質を取り除いたワイヤの約1cmでfフリーワイヤー。それらを分離保つためにピンの周りの各ワイヤにハンダ付けして金色のコネクタピンを、場所ラボテープ。
- 電極のもう一方の端では、自由な線の約3ミリメートルを持っているワイヤを準備します。 1線の最後の約1ミリメートルからエナメル質を削除し、このワイヤをバックと邪魔にならないように曲げる。これは、基準線です。これは、2つのワイヤが互いに接触裸線を持っていないことが重要です。
- 他のワイヤからシリコーン接着剤のすべての方法をエナメル質を削除します。フックにはこのワイヤーをねじると約1mmの長さに切る。このフックは、神経や筋肉にアタッチされます。ショートフックを使用すると、神経が電極に付着されているより高い安定性を提供します。
- 電極が正しく構築され、そのままであることを確認するマルチメータを使用しています。 1ゴールドコネクタには1本のワイヤの先端に関して大体200から500オームの抵抗の測定値を持つべきであり、他の金は、接続または他の線を基準に類似した読書を持っている必要があります。
- 1ワイヤーにそのまま接続がない場合には、ワイヤの再取り除き最後まで、再半田つまたはこれらの接続を作成するには、両方の金色のコネクターに可能であるかもしれません。両方金色のコネクタが両方のワイヤとの接続がある場合は、電極が接触する2裸線があるかもしれません。それは、この問題を解消するために、もう一方の端を固定することが可能かもしれない、そうでなければ、電極は捨てられるべきです。
- 実験のために必要とされるように多くの電極として、この手順を繰り返します。フック電極が神経に接続されていることをエンドを切断し、ワイヤが多くの使用後には短すぎるようになるまで、新しいフックを作成して実験する実験から再使用することができます。これが行われるたびに、電極が無傷であることを確認するために、マルチメータを使用しています。
- 実験では、ラベル電極とそのケーブルの間に異なる電極を追跡します。ラボテープの異なる色を使用すると便利です。
- 約200〜300グラムの体重の健康な動物を選択してください。海藻が表示されたら、動物は3-5秒の等間隔に強いprotractionsで刺されを生成する必要があります。
- 体重等張塩化マグネシウム溶液約50％を注入することによって、解剖トレイと麻酔動物を置きます。中央付近や動物の尾の方向を向い約15〜30度の角度で注射器を持つ最初の注入を、作る。注入後、穏やかに塩化マグネシウムを広げるために、動物の表面をマッサージします。動物の頭の方向を向いた注射器で、必要に応じて追加の注射を行います。
- 動物は穏やかな触覚刺激への応答を停止した後、尾部に1ピンと各前方触手で1ピンと、アップトレイ、背側に動物をピン。
- rhinophores後ろ、頭の真ん中に動物の皮膚をつまんで持ち上げるように鉗子を使用しています。 Mオーケちょうど開催されてポイントの背後にある動物の頭を越え冠状切開、。その後、頬マスを露出させ、口に向かってrhinophores間に今後正中矢状切開を行います。
- 頬の塊から離れてあなたに近い皮膚のフラップを引っ張って、神経と完全に頬の塊から皮膚のこのフラップを分離するために、体壁に付着した結合組織を切断するためにピンセットを使用しています。どんな神経や頬大量に固有の組織を切断しないようにしてください。
- 食道をつかんで保持するためにピンセットを使用しています。開催中のポイント後方に食道を通ってカットします。次のカットが行われると、頬の塊を持ち上げるように食道を引き上げます。
- 頬塊の後ろに、脳頬側接続詞（CBCS）によって頬神経に接続されている脳の神経節付き、リング脳、胸膜、ペダル神経フォーム。頬部に取り付けられたこれらの環神経節のままにして、これらの神経節からの他の部分に突出したすべての神経を切断ボディ。
- それが少ない本体に接続になると頬の塊を持ち上げ続け、すべての口腔マス周囲の結合組織を切断。頬の質量は口だけで接続されると、食道、口腔内質量はまっすぐに保持する必要があります。
- 本体から頬マスを解放するために、顎にちょうど前方ファイナルカットを行います。電極が接続された状態で、部分麻酔を維持するために50パーセント等張塩化マグネシウム溶液と50％ アメフラシ生理食塩水の溶液中で頬塊を配置します。
- シルガード底とペトリ皿の中で、溶液で、口腔塊を配置します。脳神経節への接続を切断することにより胸膜とペダル節を削除します。頬神経と脳の頬側接続詞（CBCS）を介して頬部に取り付けられた脳の神経節を残し、脳神経節と頬の質量の間の他の接続を断つ。彼らはグラムないように短い長さに食道、唾液腺をトリミング方法でら。
5。フック電極アタッチメント
- 記録と刺激のために、フック電極は実験（ 図2）に応じて、異なった神経と筋肉の数、に接続することができます。
- Cullinsとチール4 によって in vivo で示されるように、パターンを特徴づけるために、radular神経、筋肉、I2、および頬神経2と3に電極を取り付ける。一緒に、これらの録音は、頬マス3,7,8に固有の主要な筋肉の運動ニューロンの活性を示す、とI2の記録3、頬神経からトラクション段階2と3の録音2から延長フェーズの同定を可能にする、5,8、およびradular神経記録2から食品グラスパーの閉鎖のタイミング。刺激パターンに対して頬神経2の分岐する追加のフック電極を取り付けます。電極の添付ファイルは、そのdemonstratと同様の手順に従いますCullinsとチール4でedとは、次の手順で説明されています。
- 各電極の添付ファイルについては、粗いマニピュレータ上に電極を配置します。その端にテープワニ口クリップが付いている木の棒を、マニピュレータへと電極の端部を保持するためのクリップを使用します。クリップは約1cmシリコーンコーティングの終わりの前に、電極のシリコーン被覆セクションに添付しなければなりません。頬マス近くフック電極を配置するためにマニピュレータを使用しています。
- その側の頬の質量を持つと安定のための皿の側面に配置され、最も困難な電極の添付ファイルを提示radular神経、で始まります。この神経にアクセスするための2つのオプションがあります。
- radular神経頬神経節の下から突出して2分岐でI2が筋肉の下に行く。まず、radular神経が筋肉を切断することなくアクセスすることができるかどうかを確認します。優しくI2は筋肉に頬神経を取り付ける白いシースを掻き分けると、doこのシースを切断しない。神経がアクセス可能な場合は、神経の1枝を持ち上げるためにフックに先端を曲げたと鉗子を使用しています。
- radular神経は、この方法ではアクセスできない場合は、2番目のオプションは、薄いI2の筋肉の下に神経を見つけて、神経を露出させるためにI2の小さな切開を作ることです。この切開は、筋肉の二つの層を通って行く必要があります。筋肉の下からradular神経枝を引き出しにフック鉗子を使用しています。
- 神経の横にある電極のフックを配置するためにマニピュレータを使用しています。フックに神経を配置するには、それが同時に開催されて神経の2つの半分の間の分離を作成するために鉗子の別のペアを使用しながら、有鉤ピンセットで神経を保持しておくと便利です。
- 神経がフックにしっかりとしたら、それはピンと張ったようになるまで離れて頬の塊から神経を持ち上げるためにマニピュレータを使用していますが、伸び過ぎていません。
- キムワイプを取り、しっかりと小さな芯を形成する一角をねじる。乾燥するために、この芯を使用電極と掛けられている神経のセクションの終わり。
- 病みつきになって神経にクイックジェルスーパー接着剤の塊を適用する先の曲がった鉗子の別のセットを使用します。ワイヤーと神経の間の接触の時点でアプリケーションを開始します。フックが完全に接着剤で覆われていること、および基準線の先端が接着剤（ 図3）で覆われていないことを確認してください。
- 設定するための接着剤の表面が誘発される接着剤、上皿からのソリューションを適用するためにポリエチレンチューブアタッチメントでシリンジを使用してください。徹底的に接着剤が適切に設定されていることを確認するためのソリューションで、接着剤を入浴してください。
- 神経の緊張をほぐし、その後クリップから電極を解放するためにマニピュレータを使用しています。これは、1フック電極を取り付ける手順は完了です。
- I2は筋肉電極が横に添付しなければならない。 I2は神経が非常にSMAあるので、我々は、I2筋肉ではなく、その支配神経からENGの活動から筋活動を記録そのまま頬に大量にアクセスllと難しい。頬神経2近く、I2、筋肉の1つまたは2つのバンドを持ち上げ、筋肉の残りの部分からそれらを分離するための鉗子の別のペアを使用するように病みつきになって鉗子を使用しています。分離されたI2の部分が頬神経2または3に厚さが同じである必要があります。 （筋肉の神経をまひさせることがある）オーバー別個ないように注意してください。 radular神経に使用したのと同じ手順でフック電極を取り付けます。
- 添付する次の電極は、その枝頬神経のための2。このブランチは、電気モーターのプログラム9を誘導するために刺激することができる。頬神経2横溝I1が筋肉の下に行く前に、神経がtrifurcates;ブランチは分割した最初の分岐である。枝はかなり小さいものですので、電極の添付ファイルには注意して行う必要があります。電極を接続するために、同じ手順に従ってください。
- 頬神経2と3は簡単にアクセスできます。電気を取り付け、同じ手順に従ってください大体中途半端に頬神経節と横溝の間trodes。
- いくつかのニューロンは同側の対に対して異なる応答ので一方的な対二国間の突起を有するニューロンを区別しやすくするためには、頬のマスだけでなく、頬神経2枝の反対側に頬神経に電極2および3を添付することも有用である。反対BN2刺激。
6。ガングリオンを位置決めし、シースを薄く
- 頬の質量は、セクション2で説明ラウンド100×50mmのパイレックス皿に移動されます。 図1を参照してください。
- 真空グリースのglobをピックアップし、ノッチの上にそれを広めるためにピペットチップを用いて、脳および頬チャンバ間ノッチに真空グリースの薄い層を適用します。我々は、真空グリースがワセリンより良い漏れを最小限に抑えることを見出した。 アメフラシ生理食塩水で前室を埋める。慎重にフロントCHAMBにシャーレから頬の質量を移動神経を破ることができ、電極のいずれもしっかりと引っ張られていないことを確認しながら、この大きなお皿のER、、。
- 皿はシースを薄くするための別の双眼実体顕微鏡に転送する必要がある場合は、フック電極には充分に注意してください。グループが一緒に頬の質量の1側の電極、またグループ一緒に頬の塊の向こう側にある電極。慎重に再び電極のいずれもしっかりと引っ張られていないことを確認し、コネクタのピンをカバーラボテープを把握することによって電極を保持。
- 皿を顕微鏡下に置かれているとき、電極は皿の横のプラットフォーム上皿と残りの辺の上に優しく覆われなければならない。
- 休憩時間に、実験の段階の間に、水槽のairstoneを使って頬マスチャンバー内に生理食塩水を通気する。
- ノッチを走る脳頬側接続詞（CBCS）で逆に脳の神経節をピン。複数の真空グラムを適用CBCS以上rease、その後神経が完全に水没されるように、皿の両方の部分に多くのアメフラシの生理食塩水を追加します。漏れは、チャンバの間で発生しないように追加された真空グリースの量が脳室または口腔内の生理食塩水のいずれかのレベル以上であることを確認します。この段階では、頬の質量は、神経や神経節にあまりに無理に引っ張らないように前室の下部にくるようにしてください。
- 真ん中のプラットフォーム上で頬神経をピン。まだ頬マスに接続されている神経が損傷するのを防ぐため、2つだけの神経間のシースにピンを配置。それらを伸ばして固定するCBCSの両側にある2つ以上のピンを追加します。
- 興味のあるニューロンの位置に基づいて、頬神経節フラットまたは回転しておいてください。頬神経を回転させるには、CBCのいくつかの余分な鞘をつかむと頬神経の2と3の間にそれを突き止めるために細かい鉗子を使用しています。その後、ほとんどのバックチャンバーに近接しており、EASIできない細胞体の頬神経節の上部からアクセスLYを見ることができます。最後に、頬神経の動きを最小限にするために頬質量側に近接した頬神経の鞘に2つのピンを追加します。 図4を参照してください。
- バックチャンバーに近接頬神経の鞘をつかむために細かい鉗子を使用し、細胞体をさらすことなく、細かいハサミで余分なシースを切り取った。被害を最小限にするために、唯一の細胞体を参照するために必要なシースの量を削除します。
7。刺激と録音
- 鞘の菲薄化が完了した後、アンプに接続するケーブルには、それらのソケットにすべての電極ピンを取り付けます。繰り返しますが、これをしている間に電極がきつく引っ張られないことを確認してください。電極が正しく、適切なケーブルに取り付けられており、極性が正しいことをしていることを確認します。
- 残りの塩化マグネシウムを洗い流す、Aplysiを交換新鮮なアメフラシの生理食塩水で頬マスチャンバ内の生理食塩水。
- 顎軟骨に頬質量、anterodorsalの前面にある軟部組織を通して絹縫合糸を通し、従って、その前端から頬質量を吊り、皿の縁に縫合糸を取り付けるための粘土の2つのピースを使用しています。後端が頬神経に接続されている頬神経によって中断されていることに注意してください。
- 電極の先端が頬神経の近くになるように、ガラス細胞外電極を保持するマニピュレータを配置します。
- ニューロンを見つけ、識別するために、穏やかに神経細胞体（ 図5）の上にシース上に細胞外電極の先端を下に押すようにマニピュレータを使用しています。刺激電流を適用して、神経の細胞外電極と対応する活性（ 図6）上のアクティビティを記録するために、録音モードにソーマを励起するために使用されているチャンネルを切り替える。参照するニューロンの同定に助けのための神経突起や筋肉の神経支配（ 例えば 7,8）を含む、公開ガングリオンマップとニューロンの説明、へ。
- 摂食プログラムのビデオ記録、位置の皿側のミラーが頬質量のフロントとサイドビューは（ミラーの位置は、図1に模式的に示されている）を同時に見ることができるようにします。その視野で正面と側面の両方のビューを持つビデオカメラを置きます。
- ビデオおよび電気生理学的記録は、カメラのビュー内の電子タイマーおよびAxoGraph、電気生理学的データを記録し、分析するために使用されるコンピュータプログラムでチャネルの両方のTTLパルスを送信することによって同期させることができます。このパルスは、ファイルを同期させることができ、これに基づいて正確にAxoGraph、ビデオ録画で同じである時点を提供しています。
- ニューロンが配置された後、その活性は異なる給餌ような行動、カリフォルニア州で記録することができますnは、後述するように誘発される。
- 、拒絶反応のような運動プログラムを誘導するためには、2 Hzで、1ミリ秒のパルス9（我々の経験は、この刺激がこの設定でegestiveパターンを確実に生成することである）の長い列車とBN2-刺激する。パターンは、刺激の持続時間のために継続し、刺激が終了した直後になるまで継続することができる。
- かむような運動プログラム12を誘導するために、直接脳の神経節に固体カルバコールの少ない結晶を配置します。カルバコール露出の制御されたレベルが必要な場合あるいは、 アメフラシの生理食塩水は1〜10mMのカルバコールのソリューションを使用しています。濃度が高いほど回答が得られる可能性が高くなります。反復的なパターンは、一般的にダウンして実行を開始する前に、5分であり、約10〜15分間、最後以内に始まる。
- 誘導するために嚥下のような運動プログラム13、カルバコールを適用して、頬の質量が強い刺されが生成されるまで待ちます。その後、一口の間に、ストリップを配置歯舌は海藻（ 図7）を掴むように、動物の口の中（海苔）海藻。ストリップは長さ5cmで、通常0.5cm幅です。
- カルバコール誘発パターンの最初のシリーズの後、それは追加のカルバコール応答を得ることがしばしば可能である。徹底的に少なくとも3回を削除し、生理食塩水を交換し、脳の神経チャンバー内にアメフラシ生理食塩水を洗い流す。再びカルバコールを適用する前に、少なくとも20分間待ちます。 40分まで待って、より信頼性の高い結果をもたらす可能性があります。
米国ではこの時点では、無脊椎動物の動物は、制度動物の使用およびケア委員会による正式な承認を必要としません。しかし、我々は、 アメフラシのすべての治療法が害を最小限にし、動物に苦しみ、動物が完全に麻酔している間にすべての解剖が行われていることを確保している。
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Discussion
前の仕事は無傷動物で、そのような隔離された神経節などの還元剤、でアメフラシモータープログラムを特徴付けている。個々のニューロンのレコーディングは5を取得してきたが無傷の動物では、このような実験は非常に困難であり、電極が授乳中のニューロンへのニューロンから移動することはできません。隔離された神経は、神経活動によって誘発される摂食の動きを観察することができません。中断頬マスの準備は、この両極端の間のギャップを埋めます。
他の半無傷製剤は以前の研究で使用されますが、一時停止頬マスの準備は重要な利点がありますされています。 1半無傷準備では、唇や頬の質量がまだ取り付けられていたが、準備があまりに14を観察する飽食の動きのために減少した。 試験管内での動きを供給する供給ヘッドの準備15,16許さ観察。しかし、目頭の準備を給電していると、一時停止頬質量はここで説明するよりも設定が複雑だった、とだけ頬神経節では、脳神経節内の個々のニューロンへのアクセスを提供しない。供給ヘッドの準備に利点がある、という点で、唇と前歯触手の存在は、痛烈なパターンの生成は海藻のアプリケーション、自然の刺激を介して許可。それは実験がより困難になるだろうが、それはまた、個々のニューロンへのアクセスのために頬の神経節を固定しながら頬部に取り付けられた唇を残して、準備を組み合わせることも可能かもしれません。
アメフラシにおける摂食パターンは、モータのプログラムの長期化と後退相への相対的な食品の把持具を閉じ、radular神経、上の活動のタイミングに基づいてingestiveまたはegestiveとして分類することができます。 radular神経活動は後退局面と同時に発生した場合、パターンがingestiアールveは、それが口腔内に食物を引くしようとしてグラスパーが閉じ、後退されているためです。 radular神経活動が長期化フェーズ中に発生した場合グラスパーが閉鎖と口腔2の材料を押し出すためにprotractingされているので、パターンは、egestiveです。
Ingestiveパターンは、少なくとも2つの異なるサブタイプに分けることができます食品を把握するためにかむこと、試行、および嚥下、すでに把握食品1,2の輸送。しかし、ほとんどのin vitroでの仕事に （ 例えば 14,17,18）嚥下から痛烈区別しようとしていない、唯一の摂取/排せつ物二分法に焦点を当てている。二つの研究16,19はかむような嚥下のようなグループの in vitro ingestiveパターンに分類している。これらの研究の最初では、パターンは、単離された神経節で観察された;頬マスの関連給餌の動きを観察することができれば、これはその引数を強化するseのパターンがかむと、生体内で見られる嚥下を表しています。第二の研究では、パターンは供給ヘッドの準備で観察されたので、パターンが観察された動きに基づいて分類されていたが、頬神経節ニューロンのない録音が得られなかった。
キーを同時に頬神経と筋肉、および個々のニューロンからの刺激と記録の両方からのアクティビティを記録しながら - かむこと、嚥下、拒否 - 吊り頬マスの準備は行動のすべての3つのタイプを観察する方法を提供します。誘発した強力な摂食のような動きはほぼ確実に細胞内電極を取り除くになるため、細胞外ニューロンテクニック6は 、この調製品に含まれる別のキー前進です。多くの異なった単位がfであるため、これは、単独の神経録音にすることが困難であるとき、個々のニューロンの細胞外の録音で、モータのプログラム中に、これらのニューロンの活動のタイミングを確認することができる同時に·配線。
我々は中断頬質量の餌の動きは、生体内で見られるものと質的に同じように見えることを観察した。重要なのは、刺激（カルバコールそれぞれ頬神経2枝刺激）より減少製剤に使用され、私達の刺激が生理的な動きを生成することを見つけることは、他の設定でのそれらの使用に信憑性を貸すされた痛烈なと拒絶反応のパターンを生成するために使用される。これとは対照的に、嚥下パターンを生成するために、我々は孤立核に適用することができませんでした自然食品の刺激（海藻ストリップ）と人工刺激（カルバコール）を組み合わせる。我々はまた、中断頬質量の神経パターンが感覚フィードバックがCPGからパターンを形成する上で重要であるかもしれない示唆し、それ以上の削減準備で得られたパターンがあるより生体パターンで 、より似ているように見えることを観察した。隔離されたギャングの例では、モータのプログラム中断頬質量の運動プログラムは無傷の動物における運動プログラム（未発表データ）までの期間に一般的にはるかに近いのに対し、LIAは、無傷の動物における運動プログラムよりも持続時間が、通常、数倍長い。中断頬質量のもう一つの利点は、その同時側であり、供給装置の正面図を得ることができる。顎筋収縮の良い観察を可能にしながら、フロントビューは、生体内で見られるものに口の中の同じようなビューを提供します。サイドビューは、簡単に別の行動の間に生体力学的な変化を理解すること、頬の筋肉の収縮を観察すると筋肉の下に把持器の前方と後方への移動を可能にします。
この準備のために、我々は同時に最大5から神経（radular神経および両側頬神経2および3）とI2筋肉に記録され、識別された上の2つの細胞外電極まで配置している神経節の神経細胞。これは、実験者が必要に応じて、追加の神経及び/又は筋肉から録音することが可能であろう。また、脳の頬介在ニューロンの刺激、一般的な手法17,19は 、 生体内における挙動に似て運動プログラムを誘導するかどうかについての洞察を与えることができる脳の神経節のニューロンからの刺激と記録することが可能であろう。そうする準備の技術的な難しさを増大させるが、頬動脈15の灌流は、準備が強く、長持ち行動（未発表の観察）を生成する可能性があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、NIHの助成金NS047073とNSFの助成DMS1010434によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
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- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
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