Summary
Мы описываем технику внеклеточно записывать и стимулировать от нервов, мышц и отдельных нейронов определены
Protocol
1. Приготовление растворов
- Для подготовки хлорид магния решение, которое является изотоническим с морской водой, в которых содержатся животные (~ 1000 millosmolar), отмечают большой кувшин на уровне желаемого объема. Заполните кувшин с дистиллированной водой примерно до 80% от этого уровня, и взвесить необходимое количество магния гексагидрат хлорида для создания 333 мм решение в конечном объеме. Добавить хлорида магния в кувшин, закройте крышкой и энергично встряхивать, пока хлорид магния полного растворения, а затем добавляют дистиллированную воду до конечного объема будет достигнут.
- Для подготовки Aplysia солевым раствором, снова отметить большой кувшин на уровне желаемого объема, и залить дистиллированную воду до примерно 80% от этого уровня. Поместите кувшин на магнитной мешалки, поместить мешалкой в кувшине, и включить мешалки.
- Один за другим, взвесить и добавьте в кувшин соответствующего количества следующих веществ для создания этих конконцентрациях в конечном объеме: 460 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорид калия, 22 мМ хлорид магния гексагидрат, 33 мМ сульфата магния гептагидрата, 10 мМ хлорид кальция дигидрат, 10 мМ глюкозы, 10 мМ MOPS.
- После того, растворенные вещества полностью растворяются, используют рН-метр для измерения рН раствора. Постепенно добавить 1 M гидроксида натрия для повышения рН до конечного значения 7,5. Если вы случайно добавляйте слишком много гидроксид натрия, можно добавить 1 М соляной кислоты для снижения рН.
- Добавить дистиллированной водой до конечного объема будет достигнут.
- Чтобы замедлить рост бактерий, магазинов решений в холодильнике до необходимого для эксперимента. Обратите внимание, что температура может повлиять на программы Aplysia двигателя. Мы не внимательно следить за температурой, но после завершения установки, препараты, как правило, вблизи комнатной температуры.
2. Подготовка Запись Dish
- В ходе эксперимента, щечной масса будет приостановлено в растворекруглое 100 мм (диаметр) х 50 мм (высота) Pyrex блюдо. Это блюдо должно иметь переднюю камеру для ротовой массы, узкий, средний возвышении, где щечной ганглиев возлагаются на Sylgard, и отдельные, повышенные камеру туда, где церебральный ганглий изолирован. Выемкой в Sylgard необходимо подключить щечной платформы ганглиев в головном ганглии камеры. См. рисунок 1, ссылаясь на указанную ключевых аспектов при построении блюдо.
- Для создания этого блюда, начинается с круглой 100 х 50 мм блюдо Pyrex. Подготовка Sylgard следуя инструкции, прилагаемой к продукту. Строительство блюда потребуется несколько льется из Sylgard, между которыми Sylgard должно быть разрешено устанавливать.
- Первый застывания является создание высокого уровня Sylgard в блюдо, стена между щечной и мозговой камеры (см. Рисунок 1). Блокировать эту часть блюдо из других разделов. Моделирование глина может быть использована для созданияСтены для блокировки выключения секций. Для плоской стене, картон может быть использован, с поддержкой лепка из глины. Для изогнутую стену (которая уменьшает размеры камеры, содержащей церебральный ганглий), используют пластилин только в качестве основы для стен. Пальто все стены полиэтиленовой пленкой, где они будут обращаться в Sylgard для облегчения удаления.
- Как только место для стены между щечной и мозговой камеры был перекрыт, как описано в 2.3, обеспечение герметичности по краям, чтобы свести к минимуму утечки, залить Sylgard в это пространство почти до верхней части блюда. Пусть Sylgard набор в одночасье, и убедитесь, что он полностью установлен перед продолжением. Ввод блюдо в теплом месте будет вызывать быстрой настройки.
- Далее, щечной платформы ганглиев и мозгового ганглия камеры следует вылить (опять же, см. рисунок 1, который показывает расположение этих ганглиев в готовом блюде). Удалите предыдущие блокировки стен, и создать новую стену диПозиция 0,5 см от плоской стенки Sylgard средней части, чтобы блокировать щечной платформы ганглиев. Никакие стены, необходимые для создания заднюю камеру, которая будет проводить мозговой ганглий. Залить Sylgard в обеих секциях до высоты около 3 мм ниже верхнего уровня. Церебральный камера должна быть чуть ниже, чем ротовой платформы ганглиев. Опять же, пусть Sylgard установлено в течение ночи.
- Наконец, залить передней камеры (например, камера, в которой щечной масса будет приостановлено). Никакие стены не требуется. Налейте на соответствующую высоту, как указано на рисунке 1.
- Последним шагом является сокращение выемки подключения щечной платформы ганглиев и головного камеры. Глубина выемки должна быть такой же, как уровень щечной платформы ганглиев. Скальпель может быть использован, чтобы сократить качеством. Рисунке 1 показано завершена блюдо.
3. Подготовка электродов
- Потяните внеклеточной электроннойlectrodes от одноствольный капиллярной стекло с помощью Flaming-Brown микропипетки съемник. Внутренний диаметр электродов должно быть около 40 мкм, а их сопротивление должно быть около 0,1 Мом. С FT345B нити в съемника, наши типичные настройки программы являются съемника тепла 480, тяги 50, Vel 13, и время 20, но отметим, что параметры будут различными для разных нитей. Эта программа создает электродов в односторонней с огнем не полировки этапе. Перед началом эксперимента, засыпки внеклеточных электродов с Aplysia физиологическим раствором.
- Создайте крючком электроды для нервных и мышечных записи 2 после аналогичного протокола, описанного Cullins и Chiel 4, кроме того, что отдельные электроды не должны быть обернуты вокруг друг друга. Шаги, чтобы создать эти электроды следовать в 3.3-3.13.
- Вырежьте кусок эмаль покрытием, 0,001 дюйма из нержавеющей стали диаметром проволоки длиной около 60 см. Приложите шар пластилинана каждом конце провода, провести провода в воздух на своем средней точки, и спина двух шаров из глины вокруг друг друга, чтобы обернуть вокруг провода друг с другом (это снижает емкостной переходных процессов).
- Держа два конца провода вместе, вступив в два мяча глины в один мяч, и ленты на другом конце провода приостановить провода.
- Нанесите на всю длину провода в бытовой клей силиконовый, создав глобальную клея на большой палец, касаясь большим пальцем и указательным пальцами вместе на проводе, и запускать их по сети. Пусть клей сохнуть в течение ночи.
- После того как клей высохнет, поместите провода на плоской поверхности под бинокулярным микроскопом рассечение. Отрежьте конец проволоки, который ранее был средним, в результате чего два отдельных провода скручены между собой. Это дифференциальный электрод.
- Используйте ленту, чтобы провести один из концов электрода на месте. Используя щипцы, чтобы сдирать клей и эмали, подготовки и провода на одном конце, чтобы иметь примерно 2 см ØF бесплатно провод с около 1 см провода лишены эмали. Припой контактный разъем золота каждому из проводов, и лента место лабораторию вокруг контактов, чтобы держать их отдельно.
- На другом конце электрода, подготовить провода к около 3 мм свободной проволоке. Удалить зубной эмали от последнего около 1 мм одной проволоки, и согнуть этот провод назад и в сторону. Это ссылка на проводе. Очень важно, чтобы оба провода не имеют голого провода соприкасаются друг с другом.
- Снимите эмаль от другой провод на всем пути к силиконовым клеем. Поверните эту проволоку в крюк и сократить его до длиной около 1 мм. Этот хук будет приложить к нерв или мышцу. Использование короткого крюка обеспечивает большую стабильность, когда нерв прикреплен к электроду.
- С помощью мультиметра убедитесь, что электроды правильно построены и сохранности. Одна золотая разъем должен иметь сопротивление чтение примерно 200-500 Ом по отношению к кончику один провод, а другой золото подключенияили должны иметь такие же чтения по отношению к другим проводом.
- Если нет нетронутыми связи по одному проводу, это может быть возможным повторно лишить конце провода и вновь пайки одного или обоих золотые разъемы для создания этих соединений. Если обе золотые разъемы имеют связь с обоих проводов, электродов может иметь два оголенных проводов в контакт. Это может быть возможным, чтобы исправить другого конца, чтобы устранить эту проблему, иначе электрод должен быть отброшен.
- Повторите эту процедуру столько электроды, которые необходимы для эксперимента. Крюк электроды могут быть использованы повторно от эксперимента к эксперименту, отрезав конца, что прилагаются к нервным и создания новых крючков, пока провод становится слишком коротким, после многих применений. Каждый раз, когда это будет сделано, использовать мультиметр, чтобы убедиться, что электрод не поврежден.
- Для отслеживания различных электродов в ходе экспериментов, этикетки электродов и их кабели. Использование различных цветов лаборатории ленты полезным.
- Выбери здоровое животное весом около 200-300 гр. Когда представлены морские водоросли, животные должны производить укусов с сильными проволочек с регулярными интервалами 3-5 сек.
- Поместите животных в рассекает лоток и анестезию путем введения около 50% массы тела изотонический раствор хлорида магния. Сделать первые инъекции шприцем около 15 до 30 градусов, ближе к середине и в направлении хвоста животного. После инъекции массируют поверхность животного, чтобы распространить хлорида магния. Сделайте дополнительные инъекции при необходимости со шприцем указывая на голове животного.
- После того, как животное перестает реагировать на нежные тактильные раздражители, контактный животное к лотку, спинной стороной вверх, с одной штифт в хвост и один контакт в каждой передней щупальца.
- Используйте пинцет, чтобы зажать и снять кожу животного в середине головы, за rhinophores. Mаке корональной разрез через голову животного, сразу за точкой под стражей. Затем сделайте надрез midsagittal идти вперед между rhinophores к устью, подвергая щечной массы.
- Используйте щипцы, чтобы вытащить лоскут кожи ближе к вам от щечной массы, и прорваться через нервы и соединительной ткани, которые крепятся к стенке тела, чтобы полностью отделить этот лоскут кожи с щечной массы. Будьте уверены, чтобы не повредить нервы или любые ткани присуща щечной массы.
- Используйте пинцет, чтобы захватить и удерживать в пищевод. Разрезать пищевода кзади от точки под стражей. Потяните вверх по пищеводу поднять щечной массы, следующие сокращения сделаны.
- За ротовой массы, головного, плевральной и форме педали ганглиев кольцо, с церебрального ганглия прикреплены к щечной ганглиях головного по-щечной связок (CBCS). Оставьте эти кольца ганглиев прикреплены к щечной массу и сократить все нервы выступающие из этих ганглиев в других регионахтела.
- Разрезать соединительной ткани вокруг ротовой массу, продолжая поднимать массы до щечной, как она становится все менее связана с телом. После щечной массы только придает у рта, пищевода и щечной масса должна быть проведена прямо вверх.
- Сделать окончательный вариант только передняя к челюстям, чтобы освободить ротовую масс из организма. Поместите щечной массы в растворе 50% изотонический раствор хлорида магния и 50% Aplysia физиологический раствор в целях сохранения частичной анестезии в то время как электроды крепятся.
- Поместите щечной массы, с раствором, в чашки Петри с нижней Sylgard. Снимите плевральной и педали ганглиев путем разрезания их связи с головного узла. Оставьте церебральный ганглий прикреплены к щечной ганглиев и щечной массы через церебральный-щечной связок (CBCS); разорвать другие связи между мозговой ганглий и щечной массы. Обрежьте пищевода и слюнных желез короткие, чтобы они не ги др. в путь.
5. Вложение Hook электродов
- Для записи и стимуляции, крючок электроды могут быть присоединены к ряду различных нервов и мышц, в зависимости эксперимента (рис. 2).
- Для характеристики модели, как показано в естественных условиях на Cullins и Chiel 4, приложите электроды к радулы нерва, I2 мышцы, нервы и щечной 2 и 3. Вместе, эти записи показывают активность моторных нейронов для основных мышц присущие буккального массы 3,7,8, и позволяет идентифицировать затягивание фазы из I2 записи 3, отвод фазы из ротовой нервы 2 и 3 записей 2 , 5,8, и сроки закрытия пищи хапуга из радулы 2 записи нерва. Прикрепите дополнительный электрод крюк на ветку ротовой 2 нервов для шаблона стимуляции. Крепление электродов следует методике, аналогичной demonstratред по Cullins и Chiel 4, и описан в следующих шагах.
- Для каждого электрода привязанности, поместить электрод на крупной манипулятора. Для манипулятора, лента деревянная палка с крокодил на его конце и использование клипа провести конца электрода. Клип должен приложить к силиконовым покрытием раздела электрода, около 1 см до конца силиконовым покрытием. Используйте манипулятор для позиционирования электрода крючок рядом с щечной массы.
- С щечной массы на свою сторону и поставил к стенке блюдо для стабильности, начинают с радулы нерв, который представляет собой наиболее трудных электродов вложения. Есть два варианта для доступа к этим нервом.
- Радулы проектов нерва из-под щечной ганглия и идет под I2 мышцы на две ветви. Первое, видите ли радулы нерва могут быть доступны без сокращения мышц. Аккуратно надавите в сторону белой оболочке ротовой крепления узлов к I2 мышц; го не вырезано этой оболочки. Если нерв доступны, используйте щипцы с наконечником согнуты в крюк, чтобы поднять одну ветвь нерва.
- Если радулы нервов не доступен, таким образом, второй вариант это найти нерв под тонкой I2 мышцы, и сделать небольшой надрез в I2, чтобы разоблачить нерва. Этот разрез должен проходить через два слоя мышц. Используйте щипцы подключили тянуть филиала радулы нерва из-под мышц.
- Используйте манипулятор в положение крюка электрода рядом с нервом. Чтобы разместить нерва в крюк, было бы полезно провести нерва в зацепил пинцетом, одновременно используя другую пару щипцов для создания разделение между двумя половинами нерв проходит.
- После нерва надежно крюк, использовать манипулятор снять нервный от щечной массу, пока она не будет натянута, но не затягивать.
- Возьмите Kimwipe и плотно скрутите одном углу, чтобы сформировать небольшой фитиль. Используйте этот фитиль, чтобы высушитьконец электрода и участок нерва, который подключен.
- Используйте другой набор изогнутый кончик пинцетом, чтобы применить шарик Быстрый клей гель супер, чтобы зацепило нерва. Начать применение в точке контакта между проволокой и нервов. Убедитесь в том, что крючок полностью покрыта клеем, и что кончик ссылкой провод не покрывается клеем (рис. 3).
- Используйте шприц с вложением полиэтиленовых труб применять раствор из блюдом на клей, который будет побуждать поверхность клеем для установки. Обязательно тщательно мыть с помощью клея решение для того, чтобы клей устанавливается должным образом.
- Используйте манипулятор для устранения давления на нерв, а затем отпустите электрод из клипа. Это завершает процедуру присоединения один крючок электрода.
- I2 мышцы электрода должна быть приложена следующая. Мы записываем ЭМГ активности мышц I2, чем ENG деятельности от нервов, иннервирующих потому, что I2 нерва очень SMALL и труднодоступных в здоровом щечной массы. Рядом с щечной нерва 2, используйте щипцы подключили поднять одну или две полосы I2 мышцы, и использовать другую пару щипцов, чтобы помочь отделить их от остальных мышц. Часть I2 отделена должны быть одинаковыми по толщине щечные нервы 2 или 3. Будьте осторожны, не более, отдельный (который может денервации мышц). Прикрепите крючок электрода с той же процедуре, используемой для радулы нерва.
- Следующий электрод приложить том, что для филиала ротовой нерва 2. Эта отрасль может быть электрически стимулировать, чтобы побудить двигатель программ 9. Перед щечные нервы 2 идет под I1 мышцы на боковой канавкой, нервные trifurcates; филиал является первым ветвь отделилась. Филиалы являются довольно небольшими, так что электрод вложения следует делать с осторожностью. Выполните ту же процедуру для крепления электродов.
- Ротовая нервы 2 и 3 легко доступны. Выполните ту же процедуру, придавая электроновэлектродов примерно на полпути между щечной ганглиев и боковые канавки.
- Чтобы помочь отличить нейронов с односторонним против двусторонних прогнозам, это также полезно приложить электроды к щечные нервы 2 и 3 на другой стороне ротовой массы, а также щечные нервы 2 филиала, потому что некоторые нейроны-разному реагируют на ипсилатеральной против . контралатеральной BN2-стимуляцию.
6. Размещение ганглия и истончение оболочки
- Щечной массы будут перемещены в круглый 100 х 50 мм Pyrex блюдо описано в разделе 2. См. Рисунок 1.
- Нанесите тонкий слой смазки вакуумного выемку между мозговой и щечной камер, с помощью пипетки наконечник, чтобы поднять шарик вакуумной смазкой и распростерла его над качеством. Мы обнаружили, что вакуумная смазка сводит к минимуму утечки лучше, чем вазелин. Заполните передней камеры физиологическим раствором Aplysia. Осторожно переместите щечной массы из чашки Петри на фронт chambER этого больше блюдо, убедившись, что ни один из электродов туго натянута, которые могли бы разорвать нервы.
- Если блюдо должно быть передано другому бинокулярным микроскопом рассечение для прореживания оболочки, будьте очень осторожны с крюком электродов. Группа электродов на одной стороне ротовой массы вместе, а также группу электродов на другой стороне ротовой массы вместе. Осторожно держать электроды, держа в лаборатории ленту, которая охватывает разъема, снова убедившись, что ни один из электродов туго натянута.
- Когда блюдо расположена под микроскопом, электроды должны быть задрапированы мягко по сторонам блюдо и отдых на платформе рядом с блюдом.
- В перерывах между этапами эксперимента, аэрации раствора в ротовую камеры массового использования аквариума распылитель.
- Pin церебральный ганглий в спину с церебральным-щечной связок (CBCS), работающих через вырез. Применить более вакуум гrease за CBCS, а затем добавить еще Aplysia физиологическим раствором для обеих частей блюда, так ганглиев они полностью погружены. Убедитесь, что количество смазки вакуумного добавила выше уровень физиологического раствора в любом головного или щечной камер так не утечки между камерами. На данном этапе, щечной масса должна лежать на нижней части передней камеры, чтобы не тянуть слишком сильно на нервы и ганглии.
- Pin щечной ганглиев на середине платформы. Чтобы избежать повреждения нервов, которые все еще привязаны к щечной массы, только разместить контакты на оболочке между двумя нервами. Добавьте еще два штифта на стороне CBCS, чтобы растянуть и закрепить их.
- Держите щечной плоских узлов или поворачивать на основе расположения нейронов интерес. Чтобы повернуть щечной ганглий, использовать тонкий пинцет, чтобы захватить некоторый избыток оболочки CBC и придавить это между щечные нервы 2 и 3. Тогда большинство клеточных тел, которые, приуроченный к задней камере и не может быть EASIют доступ из верхней части ротовой ганглии могут быть видны. Наконец, добавим два штифта на оболочке ротовой ганглий, приуроченный к щечной стороны масс, чтобы минимизировать движение ротовой ганглия. См. Рисунок 4.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы захватить оболочки ротовой ганглий, приуроченный к задней камеры, а затем срезать избыток оболочку с мелкими ножницами, не подвергая клетку тела. Для того, чтобы свести к минимуму ущерб, удалить только количество оболочку необходимо видеть клеточных тел.
7. Стимулирование и запись
- После прореживания оболочки завершена, приложите все электрода контакты с их разъемов на кабели, которые подключаются к усилителям. Опять же, убедитесь, что электроды не туго натянута, делая это. Убедитесь, что электроды правильно, связанных с их соответствующими кабелями и что полярность правильная.
- Чтобы смыть оставшийся хлорид магния, заменить Aplysiфизиологического раствора в ротовую камере масс со свежим солевым Aplysia.
- Проденьте шелковых шва через мягкие ткани в передней части ротовой массы, передне-в челюсть хряща, и использовать два куска пластилина прикрепить нить к краю тарелки, таким образом, приостановление щечной массой от его переднего конца. Обратите внимание, что задний конец подвешен на щечные нервы прикреплены к щечной ганглиев.
- Установить манипулятор со стаканом внеклеточных электродов так, чтобы кончик электрода находится рядом с щечной ганглия.
- Для выявления и идентификации нейронов, использовать манипулятор аккуратно нажмите кончиком внеклеточных электродов вниз на оболочку над сомы нейрона (рис. 5). Применить стимулирующего тока, а затем переключить канал, который используется для возбуждения сома в режим записи для записи активности на внеклеточные электроды и соответствующей деятельности на нервы (рис. 6). Сослатьсяопубликованной ганглий карты и описания нейрона, в том числе нервов и мышц прогнозы иннервации (например, 7,8) за помощь в идентификации нейронов.
- Для записи видео кормления программы, положение зеркала на стороне блюдо так, чтобы спереди и сбоку ротовой массу можно увидеть одновременно (расположение зеркал схематически показано на рисунке 1). Установите видеокамеру с передней и боковой вид в своем поле зрения.
- Видео и электрофизиологические записи могут быть синхронизированы с помощью отправки TTL импульса как на электронный таймер с учетом камеры и канала в AxoGraph, компьютерная программа используется для записи и анализа электрофизиологических данных. Этот импульс обеспечивает момент времени, что точно так же в AxoGraph-и видеозаписей, на основании которых файлы могут быть синхронизированы.
- После того, как нейрон находится, его деятельность может быть записана в различных кормления типа поведения, которые окп быть вызвана как описано ниже.
- Чтобы вызвать отказ типа двигателя программ, стимулируют BN2-с длинным шлейфом 2 Гц, 1 мс импульсов 9 (наш опыт показывает, что эта стимуляция надежно генерирует egestive моделей в этот параметр). Шаблоны продолжаться в течение стимуляции и может продолжаться до тех пор пока вскоре после стимуляции заканчивается.
- Чтобы вызвать клев типа двигателя программ 12, поместите несколько кристаллов твердых карбахола непосредственно на кору головного ганглия. Кроме того, если контролируемый уровень воздействия карбахола необходимости, использовать раствор между 1 и 10 мМ карбахола в Aplysia физиологическим раствором. Более высокие концентрации чаще дают ответов. Повторяющиеся модели обычно начинаются в течение 5 мин, а в прошлом примерно от 10 до 15 минут, прежде чем начать бегут.
- Для проглатить типа двигателя программ 13, применяются карбахол, и ждать, пока щечной масс порождает сильных укусов. Затем, во время укуса, поместить полоскуводоросли (сушеные умывальник) в рот животного, так что радулы захватывает водорослей (рис. 7). Полосы, как правило, 0,5 см в ширину и 5 см в длину.
- После первой серии карбахола-индуцированной модели, часто можно получить дополнительную карбахола ответов. Тщательно промыть Aplysia солевые в коре головного ганглия камеры, удаления и замены солевых по крайней мере, три раза. Подождите не менее 20 минут перед нанесением карбахола снова. Ожидание до 40 минут может дать более надежные результаты.
В это время в Соединенных Штатах, беспозвоночные животные не требуют официального утверждения институциональных использование животных и ухода комитета. Тем не менее, мы добились того, что все лечение Aplysia свести к минимуму ущерб и страдания животного, и что все вскрытия сделано в то время как животное полностью под наркозом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущая работа характеризуется Aplysia двигателя программ в интактных животных и в условиях ограниченной препараты, такие как изолированные ганглиев. В интактных животных, хотя записи отдельных нейронов было получено 5, такие эксперименты очень трудно, и электроды не могут быть перемещены от нейрона к нейрону во время кормления. В отдельных ганглиев, кормление движения индуцированных нейронной активности не наблюдается. Приостановлено щечной подготовки массы устраняет разрыв между этими двумя крайностями.
Другие полу-нетронутыми препараты были использованы в предыдущих исследованиях, но приостановлено щечной подготовки массы имеет значительные преимущества. В одном из полу-нетронутыми подготовки, губы и щечные массы были еще привязаны, но подготовка была слишком уменьшается на полную движения кормления необходимо соблюдать 14. Подготовка кормления голова 15,16 позволило наблюдение кормления движения в пробирке. Тем не менее, якормит голову подготовки было сложнее настроить, чем приостановлено щечной масс описано здесь, и только при условии доступа к отдельным нейронов в коре головного ганглия, а не в ротовой ганглия. Существует преимущество в подготовке голову питания, в том, что присутствие губ и передних щупальцах позволило поколение модели кусаться через естественный стимул, применение водорослей. Хотя было бы сделать эксперимент более трудным, это может быть возможным совмещать подготовку, оставляя губы ассоциируются с щечной массы, а также закрепление щечной ганглиях для доступа к отдельным нейронам.
Кормление моделей в Aplysia могут быть классифицированы как ingestive или egestive на основе сроков деятельности на радулы нерв, который закрывает пищи хапуга, по отношению к затягиванию и отвода фаз двигателя программ. Если радулы деятельность нерва происходит в то же самое время, что и отвода фазы, шаблоны ingestiве, потому что хапуга закрывается и втягивания как она пытается вытащить пищи в ротовой полости. Если радулы деятельность нерва происходит во время затягивания фазы, шаблоны egestive, потому что хапуга закрывается и затягивания нажать материал, из ротовой полости 2.
Ingestive модели могут быть разделены по крайней мере на два различных подтипа: кусаться, пытается понять пищи и глотания, транспорт уже поняли еды 1,2. Однако, большинство в пробирке работы (например, 14,17,18) была сосредоточена только на прием пищи / экскреции дихотомии, не пытаясь отличить от укусов глотания. Два исследования, 16,19 отнесли в пробирке ingestive моделей в кусаться-как и глотания-подобные группы. В первом из этих исследований, закономерности наблюдаются в отдельных узлах, если соответствующие движения подачи щечной массы можно было наблюдать, это укрепит аргумента, чтоSE модели представляют кусать и глотать видели в естественных условиях. Во втором исследовании, картины наблюдались в подготовке голову кормления, так что модели были классифицированы на основе движений наблюдается, но ни одной записи в ротовой нейроны ганглиев были получены.
Приостановлено щечной подготовки массы дает возможность наблюдать все три типа поведения - кусаться, глотание, и отказ - в то время одновременной записи деятельности с ключевыми щечные нервы и мышцы, а также как стимулирующее, так и записи с отдельными нейронами. Внеклеточной техники нейрона 6 является еще одним ключевым шагом вперед в этом препарате, потому что сильные кормления, как движение вызвало бы почти наверняка выбить внутриклеточного электрода. С внеклеточной записи отдельных нейронов, сроков деятельности этих нейронов во время двигательных программ может быть установлено, когда это будет трудно с нервными записей в одиночестве, потому что много различных единиц Firing одновременно.
Мы обнаружили, что кормление движений в подвешенном щечной массы появляются качественно подобные тем, которые наблюдаются в естественных условиях. Важно отметить, что стимулы используются для создания кусаться и отказ моделей (карбахола и щечные нервы 2 филиала стимуляции, соответственно) были использованы в более уменьшена препаратов, и наш вывод, что стимулы создания физиологические движения укрепляют доверие к их использованию в других местах. С другой стороны, для создания шаблонов глотания, мы объединили искусственных стимулов (карбахола) с естественным стимулом пищи (водоросли полосы), которые не могут быть применены к изолированным ганглиев. Мы также отметили, что нейронные структуры в подвешенном щечной массы по всей видимости, больше похожи на моделей в естественных условиях, чем картины, полученные в более уменьшена препараты, предполагая, сенсорная обратная связь может играть важную роль в формировании картины от КПГ. Например, двигатель программы в изолированной бандыЛия, как правило, в несколько раз дольше по продолжительности, чем двигатель программ в интактных животных, в то время как двигатель программ в подвешенном щечной массы, как правило, гораздо ближе по длительности двигательных программ у интактных животных (неопубликованные данные). Еще одно преимущество приостановлено щечной массы, что одновременное сбоку и спереди вид на питание аппарата может быть получен. Вид спереди обеспечивает аналогичный вид на устье той, которая будет рассматриваться в естественных условиях, позволяя лучше наблюдения челюсть мышц. Вид сбоку позволяет наблюдать щечной сокращения мышц и движения вперед и назад в хапуга под мышцами, что делает его легче для понимания биомеханических изменений в разное поведение.
В этой подготовки, мы записали с пяти нервов (радулы нерва и двусторонние щечные нервы 2 и 3) и I2 мышц одновременно, и помещен до двух внеклеточных электродов над определенынервных клеток в головном ганглии. Можно было бы записать от дополнительных нервов и / или мышц, если экспериментатор лучшего. Также было бы возможным, чтобы стимулировать и записи с нейроны в коре головного ганглия, которые могли бы дать представление ли стимуляции мозговой щечной интернейроны, общая техника, 17,19, вызывает двигателем программ, аналогичных в естественных условиях поведение. Хотя делать это увеличивает техническую сложность подготовки, перфузии щечной артерии 15 может позволить подготовить для создания более сильной и более прочного поведения (неопубликованные данные).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом NS047073 NIH и NSF гранта DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
