الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Summary

الأسلوب المعروضة هنا تشمل إصابة الأجنة الزرد دقيقة حية مع نبضات الليزر عالية الطاقة وتحليل لاحقة من هذه الإصابات والشفاء مع مرور الوقت. نعرض أيضا كيف وصفت واحدة أو وراثيا يمكن تتبع مجموعات من خلايا عضلات الهيكل العظمي أثناء وبعد ضوء الليزر التي يسببها الضرر.

Abstract

وقد استخدمت أساليب مختلفة في الماوس التجريبية للحث على اصابة في العضلات وذلك بهدف دراسة تجديد العضلات، بما في ذلك الحقن myotoxin (بوبيفاكايين، cardiotoxin أو notexin)، زرع العضلات (إزالة التعصيب-الناجم عن إزالة التوعية التجديد)، وممارسة مكثفة، ولكن أيضا نماذج الفئران ضمور العضلات مثل الماوس MDX (لمراجعة هذه المناهج انظر ^1). في الزرد، والنهج الوراثية تشمل المسوخ التي تظهر الظواهر ضمور العضلات (مثل runzel ² أو sapje ³⁾ ومضاد morpholinos قليل النوكليوتيد التي تمنع التعبير عن الجينات المرتبطة ضمور ^4. الى جانب ذلك، النهج الكيميائية من الممكن أيضا، على سبيل المثال مع Galanthamine، وهو مركب كيميائي تثبيط أستيل، مما يؤدي إلى hypercontraction، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى ضمور العضلات ^5. ومع ذلك، والدوائية الجينية النهج زتؤثر enerally جميع العضلات داخل الفرد، في حين أن أكثر سهولة التحكم في مدى الجروح التي أصيب بها جسديا مكانيا وزمانيا ^1. الإصابة البدنية المترجمة يسمح بتقييم العضلات المقابل باعتبارها الرقابة الداخلية. في الواقع، كنا مؤخرا بوساطة الليزر التذرية لدراسة الهيكل العظمي خلايا العضلات التجدد في الجنين الزرد ^6، بينما مجموعة أخرى ذكرت مؤخرا استخدام ليزر ثنائي الفوتون (822 نانومتر) على الضرر محليا جدا غشاء البلازما من العضلات الفردية الزرد الجنينية الخلايا ^7.

هنا، ونحن التقرير وسيلة لاستخدام الليزر micropoint (أندور التكنولوجيا) لإصابة العضلات الهيكلية خلية في الجنين الزرد. الليزر هو ليزر micropoint الطاقة العالية الذي هو مناسبة لاجتثاث الخلايا المستهدفة في طول موجة من 435 نانومتر. توصيل الليزر لمجهر (في الإعداد لدينا، المجهر الضوئي من زايس) في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن تستخدم المجهر في نفس الوقت وأو التركيز ضوء الليزر على العينة وتصور لآثار اصابة (brightfield أو مضان). المعلمات من أجل السيطرة على نبضات الليزر الطول الموجي وتشمل، وكثافة، وعدد النبضات.

نظرا لشفافيتها والتطور الجنيني الخارجية، والجنين هو الزرد قابلة للغاية لإصابة الليزر التي يسببها كل من والانتعاش لدراسة لاحقة. بين 1 و 2 أيام بعد الإخصاب، somitic خلايا عضلات الهيكل العظمي الخضوع تدريجيا من النضج الخلفي سابقة لنظرا لتطور somitogenesis من الجذع إلى ذيل ^{8 و 9.} في هذه المراحل، نشل الأجنة تلقائيا وبدء السباحة. تم مؤخرا التعرف على الزرد الفقاريات كائن حي نموذجا هاما لدراسة وترميم الأنسجة، وأنواع عديدة من الأنسجة (القلب، العصبية، الأوعية الدموية وغيرها) يمكن تجديدها بعد الإصابة في الزرد الكبار ^{10 و 11.}

Protocol

1. وضع العلامات خلايا مفردة

حقن الأجنة مرحلة واحدة الخلية مع GFP الترميز البلازميد أو أي بروتين GFP الانصهار تحت سيطرة أحد المروجين β-أكتين. خلال التنمية، وأعرب عن GFP ثم بطريقة الفسيفساء. هنا، استخدمنا المعدلة وراثيا بناء تيراغرام [β-الأكتين: α-actinin-GFP]، الذي يضع انصهار بروتين α-Actinin-GFP تحت سيطرة المروج β-أكتين.

2. الجنين التضمين

1. جمع الأجنة الزرد والحفاظ في ظل ظروف طبيعية حتى 28 HPF (التدريج وفقا ^ل12).
2. Dechorionate الأجنة تحت stereomicroscope مع ملقط (دومون # 5).
3. إعداد شريحة المجهر مع عصابة الفازلين.
4. إعداد 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز / 10٪ tricaine حل مع E3 المتوسطة: يغلي 100 ملغ الاغاروز في حل 10 مل E3 للحصول على السائل ومتجانسة حل الاغاروز؛ قسامة وتخزينهاغير المستخدمة الاغاروز حل في -20 درجة مئوية لمدة استخدامها مرة أخرى. للاستخدام الفوري، والسماح للحل يبرد المغلي والحفاظ على الحد الأقصى. 39 ° C. إضافة tricaine محلول المخزون للحصول على تركيز النهائي من tricaine 10٪. كل tricaine والاغاروز ضرورية لمنع الحركات الجنينية.
5. تضمين الجنين واحدة في 1٪ منخفضة ذوبان الاغاروز / 10٪ tricaine / E3 المتوسطة داخل الحلبة الفازلين، مع وضع الجنين بشكل طبيعي على الجانب؛ تغطية بلطف مع ساترة لمجرد الحفاظ على الجنين في مكان وتجنب محدبة التي من شأنها كسر سطح ضوء. من الناحية المثالية، ينبغي أن الأنسجة العضلية الجنينية التي سوف تستهدف تلمس ساترة.

3. الجنين الليزر اصابة

1. إعداد والليزر micropoint المجهر:
   1. يرجى الرجوع إلى دليل ليزر micropoint للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية إعداد واستخدام الليزر بالتزامن مع المجهر.
   2. حدد الصحيحصبغة لتوليد شعاع الليزر الطول الموجي 435 نانومتر.
   3. ضبط قوة الليزر باستخدام شريط التمرير توهين. ينبغي أن قوة الليزر تكون قوية بما يكفي للخروج من سطح الزجاج مع نبض واحد (على سبيل المثال التركيز على ساترة من عينة لاختبار هذا). هذه هي قوة الليزر اللازمة لاجتثاث الخلايا.
2. التركيز على منطقة أو الخلية ذات الاهتمام باستخدام شبكاني المثبتة في العين من المجهر. استخدام الهدف 20X (40X سيسمح الضرر أكثر دقة، ولكن في كثير من الأحيان العمل عن بعد ليست كافية لهذه العدسة).

ملاحظة 1: ليزر لن تجرح فقط الخلايا داخل الطائرة التركيز، ولكن أيضا الخلايا أعلاه والتي هي تحت شعاع الليزر داخل. تأكد قبل التجربة التي تم تعيينها على النحو الأمثل ليزر يصل وتعديلها للتركيز القصوى داخل Z-المحور. فمن الأفضل لتحديد عمق الإصابة الليزر قبل تنفيذ التجربة من أجل معرفة أي خليةق سوف يكون بالضبط الجرحى.

3. إعداد تصور الضوء اللازمة لهذه التجربة: brightfield للاستخدام العادي، أو إذا مضان استهداف خلية fluorescently-المسمى.
4. إرسال نبضة من ضوء الليزر إلى المنطقة المستهدفة، أو البقول عدة، اعتمادا على الدرجة المطلوبة من الاصابة.

4. تحليل والجرح الانتعاش

1. إذا رغبت، يمكن تسجيل إجراءات الليزر الضرر الحية (على سبيل المثال باستخدام الخيار اكتساب تيار من البرنامج Metamorph) ⁶
2. مباشرة بعد اصابة، يجب إزالة الجنين بلطف من الاغاروز مع ملقط ووضعها مرة أخرى إلى المياه لاسترداد البيض.

ملاحظة 2: النشاط العضلي (السباحة والوخز) أهمية خاصة لاسترداد العضلات والهيكل العظمي. منذ الجنين لا يمكن أن تتحرك بسبب التعرض tricaine وتضمين الاغاروز شديدة، فإنه ليس recommended للحفاظ على الأجنة بين الشرائح وساترة لفترة طويلة جدا.

3. بعد الشفاء، ويمكن أن تكون ثابتة الجنين وتحليلها على النحو المرغوب فيه من الضوء، مضان المجهري، أو مبائر كما هو محدد.

Representative Results

تم إجراء الليزر إصابة بوساطة يجمد على الأجنة يوما 1. كما هو مبين في الشكل 1، يمكن للنبضات الليزر القليلة توليد جرح بسيط، يمكن التعرف عليها بسهولة من قبل التالفة، اللييفات العضلية ملفوف أكتين الغنية، التي امتدت عادة بين حدود الجسيدة. وهناك عدد أكبر من نبضات الليزر يؤدي إلا في كتلة الجسيدة تضررت بشكل كبير، حيث دمرت معظم اللييفات العضلية. ومع ذلك، يمكن أن نلاحظ أن حرفيا "الزمن يداوي كل الجراح"، يعانون من إصابات صغيرة شفاء أسرع من الكبيرة. بعد الشفاء، stainings أكتين تبين أن اللييفات العضلية تمتد مرة أخرى الجسيدة عادة، ولكن يمكن الحصول على معلومات إضافية من تلطيخ لXirp1. البروتين هو علامة Xirp1 جيدة للكشف عن الإصابة والتعافي حيث وقعت، كما يتم ترجمة ectopically على طول يتعافى myofibrils داخل خلايا العضلات أصيب سابقا ^6.

لبعض الأغراض، فمن المهم لتحديد الخلايا التي exactlوأصيب Y مع الليزر، وبالتالي، قد يكون من المفيد لتسمية بعض الخلايا وراثيا (مثل بالإعراب عن بروتين GFP mosaically الموسومة) من أجل أن تكون قادرة على تصور بدقة الخلية التي يتم استهداف ومن ثم لتقييم ما إذا كانت الخلايا المجاورة لها لديها تأثرت كذلك من قبل نبضة ليزر (الشكل 2). بعد تلطيخ الانتعاش والأجسام المضادة الإصابة، يصبح من الممكن العثور على وتحليل الخلية المستهدفة مرة أخرى بفضل نمط من الخلايا المسمى mosaically المحيطة به.

نهج واحد للاهتمام هو لمراقبة بانتظام مع مرور الوقت كيف إصابة الليزر بوساطة يؤثر على العضلات somitic. لهذا، يمكن تسجيل إصابة الجنين بالليزر يجمد حية لرؤية الآثار المباشرة، على سبيل المثال في الدقيقة الأولى (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تسجيلات timelapse مع أي الفاصل الزمني المطلوب (مثلا 5 الفاصل الزمني دقيقة)، من أجل متابعة مدى قرب إعادة ترتيب الخلاياحول الجرح.

الشكل 1. يمكن من شدة الإصابة تصيب تختلف اختلافا كبيرا، اعتمادا على عدد من نبضات الليزر تطبيقها. بناء على ذلك، التعافي من الإصابة تشرع في خطوات الفرق، ولكن في نهاية المطاف، يتم إغلاق معظم الجروح. لقد أظهرنا مؤخرا أن Xirp1 (الأخضر) هو علامة جيدة لتجديد العضلات، حيث أن upregulated فيها إلى إصابة ويموضع لغير sarcomeric أكتين (أحمر) من اللييفات العضلية التالفة في 32 HPF ^6.

الشكل 2. يمكن الخلايا المسمى تستهدف على وجه التحديد (معدلة من المرجع ^6). تسيهوصفت من قبل LLS التعبير فسيفساء من تيراغرام [β-الأكتين: α-actinin-GFP] (أخضر أو أحادية اللون). استهدف خلية واحدة من هذا القبيل هنا في 32 HPF وتضررت بشدة من نبضات الليزر عدة، كما يدل على ذلك الترباس الحمراء. السهم الأبيض يشير إلى الخلية المصاب؛ الأسهم الصفراء تشير إلى خلايا أخرى GFP-المسمى. تم التقاط هذه الصورة على اليمين بعد تلطيخ الانتعاش والأجسام المضادة للجرح نفسه.

الشكل 3. يعيش اكتساب تيار الإصابة الليزر يكشف كيف يؤثر على الإصابة كتلة الجسيدة بأكمله. المونتاج واحدة من الصور المسجلة على Axioplan في وضع بث مباشر (أي حوالي 16 إطارات / ثانية) مع شركة دبي للاستثمار. ويشير السهم الأسود حيث الليزر يضرب العضلات somitic في 28 HPF. السهام الحمراء تشير إلى التراجع ينتهي من التالفةميوفيبريل. حدثت هذه التغيرات الدينامية داخل كتلة واحدة خلال الجسيدة 2.5 ثانية.

Discussion

الليزر بوساطة الإصابة هو وسيلة قوية لإلحاق جروح من الحجم المطلوب من قبل ablating الخلايا من أجل دراسة تجديد تحت ظروف محكومة في الجنين الزرد. خاصة، ويمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا (الشكل 2) ويمكن التحكم كل من منطقة الإصابة وكذلك التوقيت. وبعد ذلك، يتم رصدها بسهولة في موقع الإصابة وعمليات التجديد، سجلت (الشكل 3) وتحليل (الشكل 1). ومع ذلك، على الرغم من أن تركز جيدا ليزر في x و y المحور، أليس كذلك ركزت تماما في Z-المحور. وهذا قد يسبب تلف الخلايا تقع تحت أو فوق خلايا في المصالح. ومع ذلك، فإن هذا النهج يفتح مجالا واسعا من التحقيقات المجراة في إصلاح العضلات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)