Do genoma deleções de genes em<em> Streptococcus sanguinis</em> Por PCR de Alto Rendimento

Summary

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida utilizando<em> Streptococcus sanguinis</em> Como um organismo modelo. Este método tem alcançado via PCRs recombinantes de alto rendimento e transformações.

Abstract

Transposon mutagênese e único gene exclusão são dois métodos aplicados no genoma nocaute de genes em ^1,2 bactérias. Embora mutagénese transposon é menos demorado, menos dispendiosa, e não requer informação sobre o genoma completo, existem dois pontos fracos neste método: (1) a possibilidade de um mutantes diferentes na biblioteca misto mutante que contra-selecciona mutantes com competição reduzida; e (2) a possibilidade de inactivação parcial do gene por meio de que os genes não perder completamente a sua função após a inserção de um transposão. Single-gene análise de deleção pode compensar os inconvenientes associados com a mutagénese transposon. Para melhorar a eficiência do genoma deleção do gene único, tentamos estabelecer uma técnica de alto rendimento para o genoma de deleção do gene único usando Streptococcus sanguinis como um organismo modelo. Cada deleção do gene construir em S. sanguinis genoma foi concebido para incluir uma-Kb a montante do gene alvo, o gene APHA-3, a proteína que codifica a resistência à canamicina, e 1-kb a jusante do gene alvo. Três conjuntos de primers F1/R1, F2/R2 e F3/R3, respectivamente, foram concebidos e sintetizados de um formato de placa de 96 poços para amplificações por PCR destes três componentes de cada apagamento construir. Primers R1 e F3 conter 25-bp sequências que são complementares a regiões do gene APHA-3 no fim do seu 5 '. Uma larga escala de amplificação por PCR do gene-3 APHA é executada uma vez para criar todas as construções de deleção de um único gene. O promotor do gene APHA-3 é inicialmente excluídos para minimizar o potencial efeito polar da cassete de canamicina. Para criar as construções de deleção de genes, de alto rendimento e de amplificação por PCR de purificação são realizados num formato de placa de 96 poços. Um fragmento amplificado de PCR recombinante linear para cada deleção do gene será composto por quatro reacções de PCR utilizando polimerase de alta fidelidade de ADN. O expon inicialfase de crescimento cial de S. sanguinis cultivados em caldo Todd Hewitt suplementado com soro de cavalo a 2,5% inactivado é utilizada para aumentar a capacidade para a transformação de PCR-recombinantes construtos. Sob esta condição, até 20% de S. As células podem ser transformadas sanguinis usando ~ 50 ng de DNA. Com base nesta abordagem, 2.048 mutantes com um único gene de exclusão foram finalmente obtidos a partir dos genes de S. 2270 sanguinis excluindo quatro ORFs de genes contido inteiramente dentro ORFs outros S. sanguinis SK36 e 218 potenciais genes essenciais. A técnica na criação de construções de deleção do gene é de alto rendimento e poderia ser fácil de usar em eliminações do genoma de um único gene para todas as bactérias transformáveis.

Protocol

1. Projeto Primer Os iniciadores são concebidos utilizando em scripts casa baseada na S. sanguinis seqüência do genoma SK36. Três conjuntos de primers, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 foram concebidos para amplificação da 1-kb de sequência a montante do gene alvo, a APHA-3 gene que codifica a resistência à canamicina (Km r) da proteína 3 e do 1 -kb de sequência a jusante do gene alvo, respectivamente (Figura 1). Entre estes iniciadores, F1 e R3 são con…

Representative Results

Após amplificação por PCR, utilizando iniciadores F1 e R1, R3 e F3 e, aproximadamente, 1 kb a montante e a jusante de cada um S. sanguinis gene foram obtidos em formato de 96 poços, respectivamente (Figura 2A). Sob as nossas condições de PCR e utilizando os iniciadores desenhados, um produto específico foi amplificado a partir de S. sanguinis ADN genómico em cada reacção de PCR. Este resultado indicou os primers foram altamente específico para as metas de S. sanguinis.</…

Discussion

Para minimizar os possíveis efeitos polares da substituição de um gene-alvo com antibióticos gene exógeno em genes vizinhos, duas medidas são tomadas enquanto cartilha inicial de projeto. Para a maioria dos genes deletados, o R1 e F3 primers são concebidos para eliminar a região codificadora de 6 pb a seguir ao codão de iniciação para 30 pb antes do codão de paragem. Os últimos 30 pares de base são mantidas para proteger local potencial de ligação ribossomal usado por um gene adjacente a jusante. A regi?…

Materials

Names	Company	Catalog#	Comments (optional)
Primer F2	Integrated DNA Technologies		TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	ibid		CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2p	ibid		GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	ibid		GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	ibid		GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5′ end_R1_seq	ibid		GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5′ end_F3_seq	ibid		GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5′ end_R1p_seq	ibid		CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep		Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Restriction enzyme
Agar	American Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Horse serum	Fisher Scientific	SH3007403	Horse serum
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamycin
TH broth	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt broth
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR purification kit
Filter	Corning	431117	0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System	Mart Microbiology b.v.	Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet’s Gel XL	Labnet	E0160	Labnet’s Gel XL
Microcentrifuge	Eppendorf	22621408	Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR system 9700