Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de hand<em> Streptococcus sanguinis</em> Als modelorganisme. Deze methode heeft bereikt via high throughput recombinant PCRs en transformaties.
Transposon mutagenese en single-gendeletie zijn twee methoden toegepast genoom knockout in bacteriën 1,2. Hoewel transposon mutagenese is minder tijdrovend, minder duur en vereist geen voltooid genoominformatie zijn er twee zwakke punten in deze werkwijze: (1) de mogelijkheid van een heterogene mutanten in de gemengde mutant bibliotheek die tegen de mutanten geselecteerd met verminderde concurrentie; en (2) de mogelijkheid van gedeeltelijke geninactivering waarbij genen niet geheel verliezen hun functie na het inbrengen van een transposon. Single-gendeletie analyse kan compenseren voor de nadelen van transposon mutagenese. Om de efficiëntie van genoom-brede enkele gendeletie te verbeteren, proberen we een high-throughput techniek voor genoom-wijde enkele gendeletie met Streptococcus sanguinis als een model organisme. Elk gen in S. deletieconstruct sanguinis genoom ontworpen om 1 omvat-Kb stroomopwaarts van het targetgen, de APHA-3-gen, dat codeert voor kanamycine resistentie-eiwit, en 1 kb stroomafwaarts van het targetgen. Drie sets van primers F1/R1, F2/R2 en F3/R3 respectievelijk zijn ontworpen en gesynthetiseerd in een 96-well plaat formaat voor PCR-amplificaties van deze drie componenten van elke deletieconstruct. Primers R1 en F3 bevatten 25-bp sequenties die complementair zijn aan gebieden van de APHA-3 gen einde hun 5'. Een grootschalige PCR amplificatie van de APHA-3 gen wordt eenmaal uitgevoerd voor het maken van alle enkel gen deletieconstructen. De promotor van APHA-3 gen aanvankelijk niet het potentiële effect van kanamycine polaire cassette minimaliseren. De gendeletie constructies te realiseren, worden high-throughput PCR amplificatie en zuivering uitgevoerd in een 96-well plaat formaat. Een lineaire recombinant PCR amplicon voor elk gen deletie wordt samengesteld door vier PCR-reacties met high-fidelity DNA polymerase. De initiële exponpreferentiële groeifase van S. sanguinis gekweekt in Todd Hewitt bouillon aangevuld met 2,5% geïnactiveerd paardenserum wordt de bekwaamheid verhogen voor de transformatie van PCR-recombinant constructen. Onder deze voorwaarde, tot 20% van S. sanguinis cellen kunnen worden getransformeerd met ~ 50 ng DNA. Op basis van deze benadering werden 2.048 mutanten met enkele gendeletie uiteindelijk verkregen uit de 2.270 genen in S. sanguinis met uitzondering van vier gen ORFs die volledig binnen andere ORFs in S. sanguinis SK36 en 218 potentiële essentiële genen. De techniek voor het maken gendeletie constructen high throughput en kan gemakkelijk in genoom gen deleties gebruiken voor transformeerbaar bacteriën.
Om de mogelijke polaire effecten van de vervanging van een targetgen met exogeen gen antibiotica op naburige genen minimaliseren, worden twee stappen terwijl de initiële primer ontwerpen. Voor de meeste van verwijderde genen, de primers R1 en F3 om de coderende regio 6 bp verwijderen na het startcodon tot 30 bp vóór het stopcodon. De laatste 30 basenparen vastgehouden mogelijke ribosomale bindingsplaats die de aangrenzende downstream gen beschermen. De bewaarde gebied tussen twee naburige genen wordt uitgebreid tot 1…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies R01DE018138 van de National Institutes of Health (PX) en gedeeltelijk door Virginia Commonwealth University Presidential Research Incentive Program (PRIP) 144.602-3 (PX). Wij danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou en Xiaojing Wang voor het assisteren bij de bouw van genoom brede mutanten. We danken ook de DNA-Core Facility in Virginia Commonwealth University voor DNA-sequencing.
Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |