Summary
Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida utilizando
Abstract
Transposon mutagênese e único gene exclusão são dois métodos aplicados no genoma nocaute de genes em 1,2 bactérias. Embora mutagénese transposon é menos demorado, menos dispendiosa, e não requer informação sobre o genoma completo, existem dois pontos fracos neste método: (1) a possibilidade de um mutantes diferentes na biblioteca misto mutante que contra-selecciona mutantes com competição reduzida; e (2) a possibilidade de inactivação parcial do gene por meio de que os genes não perder completamente a sua função após a inserção de um transposão. Single-gene análise de deleção pode compensar os inconvenientes associados com a mutagénese transposon. Para melhorar a eficiência do genoma deleção do gene único, tentamos estabelecer uma técnica de alto rendimento para o genoma de deleção do gene único usando Streptococcus sanguinis como um organismo modelo. Cada deleção do gene construir em S. sanguinis genoma foi concebido para incluir uma-Kb a montante do gene alvo, o gene APHA-3, a proteína que codifica a resistência à canamicina, e 1-kb a jusante do gene alvo. Três conjuntos de primers F1/R1, F2/R2 e F3/R3, respectivamente, foram concebidos e sintetizados de um formato de placa de 96 poços para amplificações por PCR destes três componentes de cada apagamento construir. Primers R1 e F3 conter 25-bp sequências que são complementares a regiões do gene APHA-3 no fim do seu 5 '. Uma larga escala de amplificação por PCR do gene-3 APHA é executada uma vez para criar todas as construções de deleção de um único gene. O promotor do gene APHA-3 é inicialmente excluídos para minimizar o potencial efeito polar da cassete de canamicina. Para criar as construções de deleção de genes, de alto rendimento e de amplificação por PCR de purificação são realizados num formato de placa de 96 poços. Um fragmento amplificado de PCR recombinante linear para cada deleção do gene será composto por quatro reacções de PCR utilizando polimerase de alta fidelidade de ADN. O expon inicialfase de crescimento cial de S. sanguinis cultivados em caldo Todd Hewitt suplementado com soro de cavalo a 2,5% inactivado é utilizada para aumentar a capacidade para a transformação de PCR-recombinantes construtos. Sob esta condição, até 20% de S. As células podem ser transformadas sanguinis usando ~ 50 ng de DNA. Com base nesta abordagem, 2.048 mutantes com um único gene de exclusão foram finalmente obtidos a partir dos genes de S. 2270 sanguinis excluindo quatro ORFs de genes contido inteiramente dentro ORFs outros S. sanguinis SK36 e 218 potenciais genes essenciais. A técnica na criação de construções de deleção do gene é de alto rendimento e poderia ser fácil de usar em eliminações do genoma de um único gene para todas as bactérias transformáveis.
Protocol
1. Projeto Primer
- Os iniciadores são concebidos utilizando em scripts casa baseada na S. sanguinis seqüência do genoma SK36. Três conjuntos de primers, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 foram concebidos para amplificação da 1-kb de sequência a montante do gene alvo, a APHA-3 gene que codifica a resistência à canamicina (Km r) da proteína 3 e do 1 -kb de sequência a jusante do gene alvo, respectivamente (Figura 1). Entre estes iniciadores, F1 e R3 são concebidos utilizando ePrimer3 na suite de programas EMBOSS ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) para amplificar as regiões que flanqueiam a montante ou a jusante do alvo gene. Iniciadores específicos do gene, R1 e F3, foram concebidos com base na extremidade 5 'e 3' as sequências do gene-alvo. Primers R1 e F3 contêm sequências de 25 pb adaptador no seu final 5 'que são complementares a APHA-3gene. As temperaturas de fusão de cada um dos iniciadores foram concebidos para serem tão próximo quanto possível de 60 ° C para permitir a utilização de uma temperatura uniforme do recozimento para todas as reacções de PCR em formato de 96 poços.
- F1, R1, R3, F3 e iniciadores são sintetizados em placas de 96 poços com base em uma ordem de genes. Cada placa contém um tipo de iniciadores na ordem mesmo gene. Diluir os primers em placa de 96 poços de primer de trabalho para uma concentração final de 10 uM para a amplificação por PCR, utilizando uma pipeta multicanal.
2. High-throughput Amplificação por PCR e Purificação
- Para alto rendimento amplificar 1-kb a montante ou a jusante do alvo S. genes sanguinis, montar uma mistura cocktail de PCR em gelo, num tubo cónico de 15 ml contendo 1640 uL DDH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de mistura dNTP, 100 ul de 50 mM de MgSO4, 100 ul de 10 ng / ul S. sanguinis DNA genómico SK36 e 10 ul Platinum Taq DNA polimetilmetacrilatorase de alta fidelidade e transferência de 23 uL da mistura para cada poço na placa de 96 poços de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Transferir 1 ul de cada F1 e R1 (ou F3 e R3), a partir das placas de 10 uM de iniciadores úteis para a placa de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Selar a placa de PCR e amplificação de realizar a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1,5 min.
- Prepare 1% de gel de agarose contendo brometo de etídio com 48 poços de carregamento pipeta multicanal encaixe. Mix 4 uL do produto de PCR com 1 ul de tampão de carga 5xDNA em placa de 96 poços e carregar as amostras em gel de agarose utilizando uma pipeta multicanal de 10 jil. Executar a electroforese a 135 V durante 30 min. Examine a banda em gel sob UVP documentação e sistema de análise.
- Purifica-se o produto de PCR por PureLink kit de purificação de PCR utilizando 96 de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. Para a eluição de DNA, adicionar 40 ul estéril DDH 2 O para o bem da binding placa.
- Escolher aleatoriamente vários amplicons na placa para examinar as concentrações de ADN, utilizando espectrofotometria NanoDrop. Ajustar a concentração de amplicons na placa de ~ 10 ng / ul.
- Um plasmídeo contendo km cassete r é digerido com EcoR I como molde de PCR. O plasmídeo digerido é purificado através de kit de purificação PCR QIAquick e o DNA linear do plasmídeo é ajustada para a concentração final de ADN de 10 ng / ul. Montar 25 ul de mistura de amplicon km cassete incluindo r 16,4 ul DDH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO 4, 1 ul de 10 mM F2, 1 ul de 10 R2 ^ M, 1 ul de DNA linear do plasmídeo e 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. Realização da amplificação de PCR a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1 min. Examinar o produto de PCR por electroforese em gel de agarose a 1%. Poola maior parte do fragmento amplificado cassete km r desde 10 indivíduo PCR purificado por QIAquick kit de purificação de PCR. Ajustar a concentração de amplicon de 10 ng / ul.
- Para obter a última linear amplicon de PCR recombinante, três amplicons de PCR são combinados uns com os uL 1 (em quantidades aproximadamente iguais-molar) em uma placa de PCR bem como o modelo de PCR. Outros componentes de PCR é adicionado 14,4 ul incluindo DDH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO 4, 1 ul de 10 mM de F1, 1 ul de 10 R3 ^ M, 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. A amplificação por PCR é realizada a 94 ° C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos a 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min.
- Examinar o amplicons PCR em gel de agarose. Purificar e quantificar os produtos de amplificação por PCR como descrito acima. Congelar os amplicons de PCR recombinados a -20 ° C.
3. ComPreparação Células competente
- Caldo Todd Hewitt é preparado, pH ajustado para 7,6 utilizando NaOH 10 N, aquecida à ebulição e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e esterilizada utilizando poliestireno 0,22 uM de filtro 4. Adicionar 300 ul de cavalo inactivado pelo calor soro (concentração final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt a 15 ml tubo cónico para compensar TH + HS médio. TH alíquota + HS médio em 2 ml e de 10 ml em tubos.
- Inocular 5 ul de estoque S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C em 2 ml de meio HT + HS e incubar a cultura durante a noite com capeamento hermeticamente, a 37 ° C, acompanhado por pré-incubação a 10 ml + TH-tubo HS.
- Depois de uma noite, transferir 50 ul da cultura em 10 ml de TH + HS e incubar o tubo a 37 ° C durante 3 h (correspondente a OD 660 de 0,07-0,08), imediatamente utilizando para a transformação.
4. Transformação de células e selecção de antibióticos
- Adicionam-se 2 jil de 70 ng S. sanguinis SK36 competênciatência peptídeo estimulante (CSP) e 2 ul de PCR recombinante linear amplicon (~ 50 ng) para tubos Eppendorf com 96 poços de bloco e pré-aquecê-los a 37 ° C. Transferir 330 uL de 3 hr-incubada SK36 cultura em cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 h. Substitua DNA com estéril DDH 2 O como controle.
- Colocar o bloco de gelo e espalhar 100 ul de cada transformação em infusão de cérebro e coração (BHI) em placa de ágar com 500 ug / ml de canamicina. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 d em condições de microaerofilia.
5. Confirmação mutante e Armazenamento
- Para cada mutante de substituição, aleatoriamente pegar 2 colónias individuais, inocular a colónia em 5 ml de BHI contendo 500 ug / ml de canamicina e incubadas durante a noite o inoculo microaerobically a 37 ° C. Criopreservar cada cultura em glicerol a 30% à temperatura de -80 ° C
- Para examinar se o mutante contendo o gene de substituição previsto, executar colónia PCR para cada mutante utilizando F1 e R3primers em placa de 96 poços PCR. Cerca de cultura 1-ul durante a noite a partir de colónias individuais é utilizado como o molde de ADN de 25-ul de reacção de amplificação por PCR. A PCR é realizada a 94 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min.
- Para identificar precisamente banda dupla mutantes ou amplicon PCR contaminante, examine o amplicon de PCR por eletroforese durante 4 h em> 12 cm de comprimento de 2% em gel de agarose com brometo de etídio coloração. Sob esta condição eletroforese em gel de agarose, os fragmentos amplificados com uma diferença de ≥ 100 pb foram claramente identificadas. Quando as bandas resultantes da amplificação da cassete de Km e r o gene do tipo selvagem são antecipados para diferir <100 bp, um iniciador interno T1 é usado para determinar se um gene de tipo selvagem pode ser detectada por PCR.
- Para confirmar ainda mais a eliminação, os amplicons são purificados por PureLink kit de purificação de PCR 96 e sequenciado utilizando o iniciador P1 queliga-se a cassete de r Km. Mantenha apenas os mutantes corretas confirmados por seqüenciamento.
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Representative Results
Após amplificação por PCR, utilizando iniciadores F1 e R1, R3 e F3 e, aproximadamente, 1 kb a montante e a jusante de cada um S. sanguinis gene foram obtidos em formato de 96 poços, respectivamente (Figura 2A). Sob as nossas condições de PCR e utilizando os iniciadores desenhados, um produto específico foi amplificado a partir de S. sanguinis ADN genómico em cada reacção de PCR. Este resultado indicou os primers foram altamente específico para as metas de S. sanguinis. Através de PCR re-amplificação utilizando iniciadores F1 e R3 e três amplicons como modelos lineares de ADN, construções recombinantes de PCR (~ 3 kb) foram de alto rendimento criado na placa de 96 poços, composta de uma região a montante do gene de cada alvo, uma canamicina cassete, e uma região a jusante de cada um gene alvo em que a ordem (Figura 2B). As construções recombinantes de PCR foram, em seguida, transformados em S. sanguinis SK36 e selecionados por canamicina em BHI ágar. Para a maioria dos transformations, mais de 1000 colónias foram obtidas em cada uma das placas após a 2 microaeróbia d-incubação. Quando estas colónias foram amplificadas por PCR usando F1 e R3, uma banda de ADN de cadeia simples que corresponde ao tamanho esperado mutante (~ 3 kb) foi observado por electroforese em gel (Figura 2C). Quando a tentativa de eliminar potenciais genes essenciais, sem colónias pode ser obtido na maioria dos transformações. Para eliminação de alguns genes essenciais, no entanto, as colónias foram ainda obtidas transformação seguinte. Após a amplificação por PCR de colónias utilizando estes F1/R3, duas bandas de DNA correspondendo ao tamanho esperado do mutante e do tamanho do tipo selvagem apareceu como revelado por electroforese em gel (Figura 2C). Para alguns mutantes, o tamanho esperado do mutante e do tamanho do tipo selvagem de PCR amplicon estava muito perto de ser separados por gel de agarose de comprimento. Neste caso, um iniciador interno T1 foi concebido com base na sequência do gene de tipo selvagem. A PCR foi realizada utilizando o iniciador interno um T1nd iniciador F1 (Figura 2D). O SK36 tipo selvagem foi utilizada como estirpe de controlo positivo para este PCR. Se uma banda com o tamanho esperado foi amplificado a partir do mutante utilizando o iniciador interno, o gene foi identificado como gene essencial (banda dupla mutante) uma vez que a presença da cassete de canamicina no mutante foi confirmada por sequenciação de DNA previamente utilizando o iniciador P1. Com base neste protocolo, eventualmente coletadas 2.048 não-essencial S. mutantes de genes sanguinis excluindo aqueles quatro ORFs contidas inteiramente dentro de outros ORFs (Tabela 1). Foram identificados 218 genes que são essenciais para S. sanguinis sobrevivência nas condições experimentais.
| Classe | Open-leitura frames (ORF) |
| * Total de genes | 2270 |
| Genes alvo | 2266 |
| Não essenciais (promotor APHA-3) | 1973 |
| Não essenciais (promotor APHA-3) | 75 |
| Essencial (não transformante) | 60 |
| Essencial (faixa dupla) | 158 |
* Quatro ORFs contidas inteiramente dentro de outros ORFs.
Tabela 1. S. sanguinis resumo gene mutante.
Figura 1. PCR recombinante. Três conjuntos de iniciadores (F1/R1, F2/R2 e F3/R3) foram concebidos para amplificar a sequência a montante, um gene de resistência a fármaco (Km r) e a sequência a jusante, respectivamente. Ambas extremidades 5 'dos iniciadores e R1 F3 conter co sequênciasmplementary com a cassete de um gene resistente aos antibióticos. Um produto final de PCR de ADN recombinante contendo o marcador de selecção de antibiótico flanqueado com S. sanguinis DNA genómico é produzido usando F1/R3. O DNA recombinante serão integrados S. sanguinis genoma via recombinação cross-over duplo.
Figura 2. Eletroforese em gel de Representante amplicons PCR em agarose. A, 1-kb amplicons de PCR de S. a montante ou a jusante do alvo genes sanguinis. B, os DNAs recombinantes constituídos por PCR a montante e a jusante dos genes alvo e promotor APHA-3. C, colónias de PCR a partir de fragmentos amplificados a transformação de S. sanguinis com DNAs recombinantes de PCR; bandas duplas na pista 4, 10, 14, 15, 20 e 24. D, a amplificação por PCR de colónias de tipo selvagem e mutante, usando primers F1/T1; M,mutante, W, do tipo selvagem.
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Discussion
Para minimizar os possíveis efeitos polares da substituição de um gene-alvo com antibióticos gene exógeno em genes vizinhos, duas medidas são tomadas enquanto cartilha inicial de projeto. Para a maioria dos genes deletados, o R1 e F3 primers são concebidos para eliminar a região codificadora de 6 pb a seguir ao codão de iniciação para 30 pb antes do codão de paragem. Os últimos 30 pares de base são mantidas para proteger local potencial de ligação ribossomal usado por um gene adjacente a jusante. A região retido entre dois genes adjacentes é alargado para 100 pb quando foram localizados em orientações opostas e os N-terminais de ambas as proteínas é perto um do outro para evitar a exclusão de uma região promotora potencial. O promotor do gene APHA-3 está excluída na construção recombinante para a deleção do gene 5. Um sítio de ligação ribossómica é introduzido no-3 APHA gene para a tradução. Para testar nossa estratégia, construída aleatoriamente 10 e depois 96 mutantes câmbio alélicas. Nós óbtained 10 e 93 mutantes, respectivamente, em placas de selecção de canamicina, sugerindo que o promotor menos APHA-3 gene foi expresso bem na maior parte dos casos. Em seguida, desenhados e sintetizados o iniciador-promotor para menos APHA-3 gene para todas as deleções de genes em S. sanguinis genoma. No entanto, encontramos alguns genes em S. sanguinis foram baixo expressa ou não expressa o que provavelmente irá afectar a expressão do gene promotor APHA-3 e, portanto, da selecção de canamicina. Para resolver este problema, o promotor do gene APHA-3 a partir do plasmídeo foi introduzido na cassete r Km. A maior parte do promotor de amplicon cassete km r foi obtido a partir de 10 utilizando iniciadores de PCR individuais F2p/R2. Excepto que R1 novo promotor R1p primers foram concebidos para complementar com o promotor da cassete amplicon km r, todos os outros passos de construção foram os mesmos que para o promotor-less construção.
Para melhorar a efficiency de recombinação homóloga, seleccionamos longos (1 kb) que flanqueiam as sequências a montante ea jusante do S. sanguinis gene alvo na tomada de deleção do gene-constructos. O tamanho sequência flanqueadora foi limitada a 1 kb, com base em dois pontos: (1) o comprimento do fragmento de DNA (~ 3 kb) permitiu a amplificação por PCR do gene pronto APHA-3 (~ 1 kb) mais 2 kb de sequências que flanqueiam usando de alta fidelidade da polimerase de ADN, e (2) a possibilidade de sequenciação de regiões flanqueadoras pelo método de sequenciação ABI a partir de ambas as extremidades (~ 1 kb). Um elevado número de transformantes em mais de S. deleções de genes sanguinis indicou uma seqüências kb a montante ea jusante, respectivamente, foram o suficiente para nocautear os genes alvo.
Para ligar com sucesso a montante e a jusante do gene alvo, com as duas extremidades da APHA-3 em amplificação por PCR do gene recombinante, primers R1, F2, F3 e R2 irá ser adicionado à sua extremidades 5 'de uma sequência adicional que é complementar com a connecting final do outro lado, em muitos casos de genes de bactérias de exclusão 6,7. Os estudos preliminares mostraram que a sequência adicional pode ser reduzida para 25 pb para este protocolo de PCR recombinante. Neste protocolo, que eliminou as sequências adicionais de primers F2 e R2 em APHA-3 gene e adicionou-se 25 pb de sequência adicional para a extremidade 5 'de R1 e F3 em a montante e a jusante do S. sanguinis gene alvo. Esta concepção irá diminuir a duração e quantidade de iniciadores e, consequentemente, reduzir o custo e os tempos de PCR para melhorar a eficiência de um único gene de eliminação. No nosso laboratório, esta concepção também tem sido demonstrado com sucesso para inactivação de genes de outros micróbios, tais como Streptococcus mutans e Streptococcus pneumoniae, e Porphyromonas gingivalis.
Neste protocolo, a especificidade dos iniciadores de PCR é crítica. A temperatura de fusão primário era elevada (> 58 ° C), o tamanho do iniciador foi prolongado (> 21 pb), e o iniciador bilocal nding era único no genoma de S. sanguinis. Este desenho produzido único gene-específicos produtos em quase todas as nossas amplificações por PCR. Um produto específico do gene de amplificação por PCR simples é crítico para a amplificação de PCR anterior. Caso contrário, a amplificação por PCR final que resulta na formação do composto final, recombinante das regiões a montante e a jusante dos genes da doença e cassete de gene antibiótico, respectivamente, seria difícil.
Densidade celular-dependência de transformação tem sido demonstrada em muitos estreptococos, tais como S. sanguinis 8, S. mutans e S. 9 pneumoniae 10. Quando a densidade de células de S. sanguinis atingiu um OD 660 de 0,07-0,08 (correspondendo a ~ 5x10 6 CFU / ml), em TH + HS meio, a maior eficiência de transformação de S. sanguinis com um fragmento amplificado por PCR recombinante linear foi obtida e até 20% de S. células sanguinispoderia ser transformado. Após a conclusão das eliminações do genoma de genes em S. sanguinis, verificou-se que o número de transformantes para eliminação de alguns genes não essenciais foi baixa (~ 10). Não há dúvida de que a eficiência de transformação de alta de bactérias é importante para satisfazer todas as deleções de genes não essenciais nos nocautes do genoma de genes.
Excepto para a criação de construto recombinante por PCR, existem também outras técnicas para a inactivação do gene único. Por exemplo, a criação de plasmídeo suicida foi extensivamente aplica para inactivar os genes de bactérias, em pequena escala. No entanto, esta técnica não tem sido utilizado para a inactivação do genoma único gene em grande escala, porque a criação de plasmídeo é muito demorado e laborioso, e algumas bactérias devem ser criados suicídio específico plasmídeo. Embora o marcador de menos de deleção do gene pode evitar o possível efeito polar do gene de resistência a antibióticos, marcadores menos tradicional método de deleção do gene é mais tempo con-suming e difícil para inactivar um gene que o método plasmídeo suicida. Em E. coli, as deleções do genoma de marcação menos de genes foram obtidas através de substituição com o gene de resistência a antibióticos e, em seguida, a eliminação da cassete de resistência 6. No entanto, esta E. coli requer a recombinase Red do fago λ. Antes de deleção do gene-transformação, o pKD46 helper Red plasmídeo deve ser introduzido em E. coli 11. Na nossa técnica, eliminado o promotor de APHA-3 do gene de resistência, em que a grande maioria dos genes mutantes-excluídos e concebido as duas extremidades do-APHA ORF-3 a seguir a estrutura de expressão do gene-deleted região, a fim de evitar o polar emissão efeito da cassete de resistência. Até agora, não encontramos a questão efeito polar depois de examinar a função de muitos mutantes criados por esta tecnologia. Um conjunto de todo o genoma e clara de genes essenciais adquirida em S. sanguinis usando ªé técnica 12 também implica baixa possibilidade do efeito polar da cassete de antibiótico no sistema. Nós demonstramos outros promotores menos genes de resistência aos antibióticos, como a eritromicina e genes de resistência a cloranfenicol, poderia ser aplicado nesta técnica (dados não mostrados). Além disso, esta técnica não necessita de acolhimento plasmídeo suicida e reconstruídas. No geral, esta técnica é de alto rendimento para criar genoma construções de deleção do gene e poderia ser fácil de executar no genoma mutação único gene de uma bactéria.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações R01DE018138 dos Institutos Nacionais de Saúde (PX) e, em parte, pela Virginia Commonwealth University Programa de Incentivo à Pesquisa Presidencial (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos os drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang para ajudar com a construção de mutantes do genoma de largura. Agradecemos também o Core Facility DNA da Virginia Commonwealth University de sequenciamento de DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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