Summary
אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף בניקוד
Abstract
הפרעה דו גדיל RNA בתיווך (RNAi) היא אסטרטגיה יעילה כדי להפיל יעד ביטוי גני 1-3. זה כבר מיושם על מערכות מודל רבות, כוללים צמחים, חסרי חוליות ובעלי חוליות. קיימות שיטות שונות להשגת RNAi in vivo 4,5. לדוגמה, גן היעד עשוי להפוך לוקטור RNAi, ולאחר מכן שינה באופן קבוע או זמנית לשורות תאים או תאים ראשוניים כדי להשיג השפעות מציאת גן; לחלופין מסונתז oligonucleotides גדיל כפול מ גני המטרה ספציפיים (RNAi oligos) עשוי להיות transiently הופכים לשורות תאים או תאים עיקריים להשתיק גני המטרה, או מסונתז מולקולות דו גדיל RNA עשויות להיות microinjected לאורגניזם. מאז נמטודות ג elegans משתמש חיידקים כמקור מזון, להאכיל את החיות בחיידקים מבטאים-RNA גדיל כפול נגד גני המטרה מספק אסטרטגיה מעשית 6. כאן אנו מציגים האכלת RNAiשיטה להבקיע פנוטיפ גודל גוף. גודל גוף בג elegans מוסדר בעיקר על ידי TGF-β - יגנד כמו DBL-1, ולכן בדיקה זו היא מתאימה לזיהוי של רכיבי TGF-β איתות 7. אנחנו השתמשנו זנים שונים ביניהם שני זנים רגישים יתר RNAi לחזור על ניסויי האכלת RNAi. התוצאות שלנו הראו שrrf-3 מתח נתן לנו את הפנוטיפ RNAi הצפוי ביותר. השיטה קלה לביצוע, לשחזור, ולכמת בקלות. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו ממזער את השימוש בציוד מיוחד, ולכן הוא מתאים למעבדות קטנות יותר או אלה בעיקר במוסדות לתואר ראשונים.
Protocol
1. הכנת צלחות האכלת RNAi נשיאת רצף גן המטרה
- אם אתם משתמשים בספריות RNAi זמינות מסחרי (למשל מהמקור LifeSciences Bioscience), המשך לשלב 1.4. לחלופין, לשכפל רצפי גני היעד לוקטור L4440, תולעת RNAi 8 פלסמיד נפוץ, על ידי פרוטוקול שיבוט סטנדרטי.
- להפוך פלסמיד רקומביננטי לזן חיידקים HT115 (DE3), תרבותם על צלחות אגרו LB עם 25 מיקרוגרם / המ"ל carbenicillin ו12.5 מיקרוגרם / המ"ל טטרציקלין, ולאסוף שיבוט יחיד לשימוש עתידי.
- בינתיים, להפוך L4440 הווקטור הריק למתח HT115 חיידקים לשימוש כשלט לניסויים.
- תרבות L4440 נושאים את החיידקים גם רקומביננטי וריקים במרק 1 מ"ל LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין לילה בשעת 37 ° C. טטרציקלין לא הוסיף בשל עובדה שזה מקטין את יעילות RNAi.
- הוסף עוד 5 מיליליטר מרק LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין לcultu הלילהמחדש, דגירה במשך 4-6 שעות נוספות בשעת 37 ° C.
- 0.5 מ"ל רקומביננטי זרעים או ריק L4440 נושאות תרבות חיידקים לצלחות תולעת RNAi. לתייג את כל הצלחות עם שם שיבוט.
- סמן את הצלחות ודגירת הלילה בשעת 37 ° C לצמוח דשא חיידקים, אלו הן צלחות RNAi עם או בלי רצף גן המטרה. לפחות 2 צלחות צריכות להיות מוכנות לכל מצב.
2. תולעי תרבות על צלחות האכלת RNAi
- להבה לעקר את קצה חוט בחירת תולעת פלטינה. השתמש בתולעת לאסוף לאסוף שלב זחל 4 6-10 (L4) הרמפרודיטים לכל צלחת RNAi המכילה L4440 או רקומביננטי או ריק; החיות תשתמשנה בחיידקים כמקור מזון.
- בואו הרמפרודיטים לגדול ב 20 ° C למשך הלילה (מצב סטנדרטי לתרבות אלגנס), הם יהפכו למבוגרים צעירים ביום שלמחרת.
- להעביר 6-10 מבוגרים צעירים לתוך צלחת שכותרת בהתאם והכין חדשה RNAi.
- בואומבוגרים מטילים ביצים במשך 4-6 שעות, ולאחר מכן להסיר את כל המבוגרים מהצלחת; שלב זה הוא לסנכרן את הצאצאים. ברגע שהאמהות מוסרות, מתחיל לספור זמן. זה זמן אפס.
- דגירת הצלחות ב 20 ° C כדי לתת חיות לגדול לשלב התפתחות מסוים; בפרוטוקול זה, אנו בוחרים אנשים צעירים לניתוח פנוטיפית. הנוקאוט המתפתח בקצב נורמלי, דגירת 72 שעות מספיקה לבעלי חיים כדי להפוך למבוגרים צעירים. עם זאת, גנים שונים משפיעים על התפתחות חיים בצורה שונה. אם RNAi גורם חיות לגדול בקצב שונה, מבוגרים הצעירים ניתן לזהות אלו לא יותר מאשר 24 שעות האחרונות L4 עם פיתוח השלים פות ו2-6 עוברים ברחם (אם פורה). כדי לזהות שלבי התפתחות אחרים, חוקר צריך להשתמש התפתחות אשכים ופות כמדריך.
3. פנוטיפים גודל גוף ציון של RNAi מטפלים בתולעים
- הנח שתי שכבות של קלטות תווית צבעוניות בשקופית זכוכית. הפכו שתייםשקופיות זכוכית se. לאחר מכן, הנח שקופית זכוכית חדשה בין שתי שקופיות עם קלטת. ממסים 2% agarose במים; להחיל טיפה אחת למרכז שקופית הזכוכית החדשה, ולאחר מכן לחץ על שקופית הכוס השנייה בחלק העליון כדי לעשות שכבה דקה של 2% agarose כפי שתואר לעיל 9.
- לאחר agarose הוא מוצק, להסיר את שקופית הזכוכית העליונה; השקופית עם כרית agarose מוכנה לטעון תולעים. שקופית תווית עם שם שיבוט.
- הוסף 10 μl 25 מ"מ 3 NaN לagarose הפנקס; לאסוף חי 30-40 ל3 פתרון NaN כדי לשתק אותם, ואז לשים על coverslip העליון; חוזר עבור שניהם רקומביננטי והריק נושא-L4440 חיות שטופלו ב-RNAi.
- תמונת התולעים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות עדשה אובייקטיבית 2.5x; כאן אנו משתמשים מצלמה דיגיטלית יקה עם תמיכת Qcapture תוכנה.
- לכיול, ראשון ללכוד תמונה של שליט מיקרומטר סטנדרטי. ואז לפתוח את התמונה בתוכנת Image-Pro, לחץ על "מידה" ובחר באפשרות "כיול" ואז לבחור"אשף כיול המרחבית". עם "לכייל את התמונה הפעילה" שנבחרה, לחץ על "הבא". הקלט שם לכיול ולהבטיח שיחידות ההתייחסות מרחביות מוגדרות מיקרומטר. לאחר מכן, בדוק "ליצור הפנית הכיול" הכפתור וללחוץ על "הבא". לחץ על "קו התייחסות תיקו." סרגל קנה מידת התייחסות יופיע. שנה את מיקום סרגל קנה המידה כדי להתאים את הקצוות של מיקרומטר, ולאחר מכן ציינתי שההתייחסות מציינת 1,000 יחידות. לחץ על "אישור", "בא", וגם "סיום".
- לאחר שהתוכנה מכוילת, לפתוח תמונה עם תולעת. לאחר מכן, בחר בתפריט "המדד", בחר "כיול" ואז ללחוץ על "בחר המרחבית". בתפריט הנפתח, בחר את שם קובץ שנוצר לכיול מיקרומטר. לאחר מכן, תחת התפריט "המידה", בחר "מדידות". בחלון שנפתח, בחר בכלי חופשי לצייר ולשרטט קו דרך מרכז גוף החיה מראש ועד זנב עם עכבר מחשב (איור 1). האורך ידווח בחלון. עכשיויש לך שתי קבוצות של נתונים: אורך גופם של בעלי חיים שטופלו ביעד הגן RNAi וחיות בקרה שטופלו בL4440 וקטור ריק.
- לייצא את מדידות אורך לקובץ של Microsoft Excel, או תוכנה סטטיסטית מתאימה אחרת. לנתח את הנתונים על ידי חישוב הסטייה הממוצעת וסטנדרטית לכל דגימה. לאחר מכן, השווה דגימות באמצעות מבחן t של סטודנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר שלנו, אנו מתמקדים בויסות משקל גוף על ידי נתיב DBL-1/TGF-β. אובדן התפקוד של תוצאות DBL-1 המסלול בגודל גוף קטן, כולל אורך גוף קצר יותר בהשוואה לבעלי חיים פראיים מסוג 7,10,11. לפיכך, מסכים לג מוטנטים גודל גוף elegans הם מסוגלים לזהות רכיבים ומכפילי איתות TGF-β. DBL-1 איתות מתווכת על ידי מסלול TGF-β משומר אות תמרה הכולל קולטנים בתא שטח ומתמר אותות תאיים Smad 12. בכדי לבחון את היעילות של RNAi ידי האכלה לזיהוי של מוטציות גודל גוף, השתמש בטכניקה זו כדי להפיל DBL-1 מרכיבים שונים של מסלול: dbl-1/ligand; SMA-2, SMA-3, sma-4/Smads; ו sma-6/receptor. למחקר שלנו, השתמש בשני RNAi הרגיש ג שונה elegans זנים לביצוע ניסוי: בארי-1; lin-15B וrrf-3 13,14. בינתיים, אנחנו גם משמשים N2 (standard פרוע סוג) מתח וlin-36, מרכיב במסלול לין-15 שRNAi רגישות היא בכל זאת דומה לN2 13. התוצאות שלנו (איור 2) תכנית שכל זנים אלה מוצגים פנוטיפ גודל הגוף הקצר כצפוי (p <0.001), למעט SMA-6 RNAi ב- 36 לין רקע. ברקע rrf-3, אורכי גוף של בוגרים הצעירים לאחר טיפול RNAi היו 84 ~ 95% מוקטור לבד. בבארי-1; lin-15B רקע, אורכי גוף של צעירים אחרי RNAi היו 68 ~ 86% מחיות בקרה. בהשוואה לזני lin-36 וN2, הן של RNAi הרגישים זני rrf-3 ובארי-1; lin-15b היה רגיש יותר.
איור 1. תמונות מייצגות של אורך גוף חיה נמדדות תמונת חית א 'לפני המדידה.
איור 2. אורך גופם של בעלי חיים שבו מרכיבים השונים של מסלול DBL-1 היו מומתים בשיטת האכלת RNAi. חי RNAi בכל זני רקע אלה מוצגות פנוטיפ אורך הגוף הקצר כצפויות (p <0.001), למעט SMA-6 RNAi בlin-36 רקע. RNAi של rrf-3 ובארי-1; זני lin-15B הפגין פנוטיפ חזק מזו של לין-36 ורקע N2.
איור 3. סכמטי דescription של שימוש באסטרטגית האכלת RNAi להקרין לגני המועמדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה שלנו לזיהוי של מוטציות פגומות גודל גוף של ג elegans ידי האכלת RNAi. שיטה זו ישימה לזיהוי רכיבי איתות TGF-β. מאחר שהרכיבים אלה שמורים ביותר עד 15 אבולוציה, מסכים אלה רלוונטיים להבהרת המנגנונים המולקולריים של איתות TGF-β בכל metazoans. שיקול חשוב בעיצוב מסך כזה הוא מתח המוצא. אנחנו הוכחנו שגם בארי-1; lin-15b וrrf-3 הם רגישים יותר להאכלת RNAi מאשר זני בקרה, העולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים 12,13. עם זאת, למרות שבארי-l; lin-15b הוכיח את הפנוטיפ החזק, החיות לא גדלו היטב ופיק כמה צאצאים. לכן, במסך גדול, לא היו לנו מספיק חיות עבור בקיע פנוטיפים מזן זה. כתוצאה מכך, אנו מעדיפים-3 rrf להתאמץ כדי להחילטכניקת האכלת RNAi לרגולצית גודל גוף. בחירה שנייה לשקול במתח המוצא היא אם לפתוח מסך עם מסלול DBL-1 השלם או להתחיל עם זן רגיש שבמסלול DBL-1 נמצא בסיכון או פעילות יתר או. נקודתי מוצא חלופיים אלה עשויות להוביל לזיהוי של חפיפה אבל הסדרות שונות של רכיבי איתות. הפרוטוקול שלנו יכול גם להיות שונה כדי המחקר של פנוטיפים postembryonic אחרים. במקרה זה, בשלב בו בעלי החיים שקלעו לפנוטיפ של עניין ייתכן שיהיה צורך לשנות על ידי שינוי משך הצמיחה בשלב 2.5. לפני שתתחיל במסך בקנה מידה גדול לפנוטיפים אחרים, אנחנו ממליצים על מסך טייס עם גנים ידועים לייצר את הפנוטיפ של אותה הריבית כפי שאנו מתארים כאן לdbl-1, SMA-2, SMA-3-4-SMA, וSMA- 6.
באמצעות פרוטוקול זה, הפל את המרכיבים שונים של מסלול DBL-1 הראה פנוטיפ אורך הגוף צפוי. Tחי RNAi צינור היו כ 68-95% באורך לעומת חיות בקרה. במחקרים קודמים, אובדן DBL-1 מסלול של מוטציות גנטיות תפקוד בבגרות על 50% קצרים יותר מחיות פראיות מסוג 7,10,11. לכן, טכניקת האכלת RNAi הוצגה כאן לא לחסל את פעילות גן באופן מלא. לכן, השיטה עשויה להיות מוגבלת ביכולתה לזהות את המרכיבים השונים של מסלול שיש להם פנוטיפ חלש. בינתיים, מכיוון שיש גנים רבים המווסתים את אורך גוף, גנים שזוהו מהמסך גם לא בהכרח נופלים במסלול DBL-1. ניסויים נוספים יש לבצע כדי להציב את המועמדים במסלולים, והוא דין לכל שיטת מסך אחרת.
לסיכום, מסכי האכלת RNAi בג elegans הוכיח שימושי בזיהוי הגנים מעורבים בתהליך של ריבית. בפרוטוקול זה, יש לנו מותאם פרוטוקולים קיימים להיות יעיל מאוד בזיהוי פגמי גודל גוף. הפרוטוקול האופטימלי יכול להיות עוד יותרשונה לחקר פנוטיפים postembryonic אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לג'יימס קלארק למתן דמויות של חיות בנקודתי זמן שונים של התפתחות. ג זני elegans במחקר זה נלקחו מCaenorhabditis גנטיקת המרכז, אשר נתמך על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). עבודה זו נתמכה על ידי CIRG 1817 מCUNY לJL וCSD; ועל ידי NIH 1R15GM073678-01 ו1R15GM097692-01 לCSD אנו מודים לד"ר ויליאם J רייס, ד"ר נטליה הולצמן, ומליסה Silvestrini להערות על כתב היד. עבודה זו בוצעה במילוי חלקי של הדרישות לקבלת תואר דוקטור ממרכז בוגר אוניברסיטת העיר ניו יורק (ס 'שיונג).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
