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Biology

使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略 doi: 10.3791/4373 Published: February 13, 2013

Summary

我们演示了如何使用供给的RNAi技术敲除目标基因和分体尺寸型

Abstract

双链RNA介导的干扰(RNAi)是一种有效的策略,以击倒靶基因的表达1-3。它已被应用到许多模型系统,包括植物,无脊椎动物和脊椎动物。有各种各样的方法来实现RNAi 在体内 4,5。例如,可以与靶基因的RNAi载体转化,然后永久或瞬时转化的细胞系或初级细胞实现的基因敲除效果,或者从特定的靶基因(RNAi的寡核苷酸)的合成的双链寡核苷酸,可以是瞬时转化靶基因沉默的细胞系或原代细胞或合成的双链RNA分子可显微注射到生物体。由于线虫C.的利用细菌作为食物来源,饲养的动物与对靶基因的表达双链RNA的细菌提供了一个可行的策略。在这里,我们提出的RNAi输送机身尺寸表型的方法来得分。车身尺寸C.线虫主要受型TGF-β -等配位体DBL-1,所以该法是适合识别的TGF-β信号元件7。我们使用不同的菌株,其中包括两个RNA干扰过敏株重复供给的RNAi实验。我们的研究结果表明,RRF-3株给了我们最好的预期的RNAi表型。该方法易于操作,重现性好,易于量化。此外,我们的协议,最大限度地减少了使用专门的设备,所以它是适合于规模较小的实验室或主要是本科院校。

Protocol

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1。准备携带目的基因序列的RNA干扰进料板

  1. 如果使用市售的RNAi库( 例如,从源生物科学生命科学),继续执行步骤1.4。另外,克隆到载体L4440,一种常用的蠕虫RNAi质粒8的靶基因序列,通过标准的克隆协议。
  2. 变换的菌株HT115(DE3)中,用25μg/ ml的羧苄青霉素的LB琼脂平板上培养和12.5微克/毫升四环素的重组质粒转化,并挑选单个克隆,以备将来使用。
  3. 同时,转换到菌株HT115使用的实验作为对照的空载体L4440。
  4. 文化重组和空L4440携带的细菌在1毫升LB肉汤与100μg/ ml氨苄青霉素过夜,在37°C。四环素还没有添加由于事实,即它减小RNAi效率。
  5. 添加另一5毫升隔夜丘尔到100μg/ ml氨苄青霉素的LB肉汤重,另一个孵育4-6小时,在37°C。
  6. 种子0.5毫升重组或空L4440携带细菌培养到的RNAi蠕虫板。标记所有板与克隆名称。
  7. 马克板孵育过夜,在37℃至生长细菌草坪;这些的RNAi靶基因序列的带或不带板。至少有2块板应为每个条件制备。

2。文化蠕虫的RNAi送料板

  1. 火焰消毒,铂丝的尖端蠕虫挑。使用WORM挑来挑去6-10第四幼虫期(L4)雌雄同体每个RNA干扰板,重组或空L4440的动物将使用细菌作为食物来源。
  2. 让雌雄同体的增长,在20°C(一个标准的文化条件线虫 )过夜,他们将成为年轻的成年人的第二天。
  3. 6-10青壮年转移到一个新的相应标记,并准备RNA干扰板。
  4. 让成人产卵4-6小时,然后取出所有的成年人板,这一步是同步的后代。一旦母亲被删除,开始计时。这是时间为零。
  5. 将培养板在20°C,让动物长到特定的发展阶段,在该协议中,我们选择了年轻的成年人表型分析。击倒在一个正常的速度发展,培养72小时是足够的动物成为年轻的成年人。然而,不同的基因影响动物的不同发展。如果RNAi技术使动物生长速度不同,年轻人可以被认定为不超过24小时过去L4完成外阴的发展和2-6胚胎在子宫内(育)。要确定其他发展阶段,研究人员应使用性腺及外阴的发展为导向。

3。分数车身尺寸表型的RNAi治疗的蠕虫

  1. 将两层颜色标签磁带在载玻片上。使两个本身载玻片上。然后,将一个新的载玻片上,在两者之间的幻灯片用胶带。熔体在水中的2%琼脂糖;应用一个下拉到中心的新的载玻片上,然后按下顶端的第二玻璃上滑动,使一层薄薄的2%琼脂糖如前所述9。
  2. 琼脂糖凝固后,取出顶部的载玻片上,,琼脂糖凝胶垫的幻灯片已经准备好加载蠕虫。标签幻灯片与克隆名字。
  3. 加入10微升25毫米NaN的3琼脂糖垫;选择30-40动物的NaN 3解决方案,以固定,然后把盖玻片的顶部,重复重组和空L4440携带的RNA干扰治疗的动物。
  4. 在解剖显微镜下的图像的蠕虫使用2.5倍的物镜,这里我们使用徕卡数码相机与支持软件Qcapture的,。
  5. 校准,第一次拍摄图像的标准千分尺尺。然后打开图像的Image-Pro软件中,点击“测量”,然后选择“校准”,然后选择“空间校准向导”。随着“校正活动图像”选中,单击“下一步”。输入的名称的校准和确保的空间参考单元被设置到微米。然后,检查“创建参考校准”按钮,然后单击“下一步”。点击“参考线”。会出现一个参考比例尺。重新放置比例尺的千分尺的端部相匹配,则表明参考表示1,000个单位。点击“确定”,“下一步”,“完成”。
  6. 一旦软件校准,打开一个蠕虫图像。然后,选择“测量”菜单下,选择“校准”,然后点击“选择空间”。在下拉菜单中,选择创建的文件名千分尺校准。然后,在“测量”菜单中,选择“测量”。在打开的窗口中,选择“自由绘制工具,并通过动物的身体,从头部到尾部与电脑鼠标( 图1)的中心跟踪线。将在窗口的长度。现在你有两组数据:体长,治疗靶基因的RNAi和处理空L4440矢量的控制动物的动物。
  7. 导出到Microsoft Excel文件,或其他合适的统计软件的长度测量。的数据进行分析,通过计算每个样本的平均值和标准偏差。然后比较学生的t检验的样品。

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Representative Results

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在我们的研究中,我们专注上机身尺寸调节的DBL-1/TGF-β途径。 DBL-1途径体型小,更短的车身长度相比,与野生型动物7,10,11功能的损失。因此,屏幕为C.线虫的机身尺寸突变体能够确定TGF-β信号组件和改性剂。 DBL-1信号是介导的一个保守的TGF-β的信号转导途径,其中包括细胞表面受体与细胞内的Smad信号传感器12。要测试的有效性的RNAi通过喂养的车身尺寸突变体的识别,我们使用了这种技术击倒DBL-1通路组件:dbl-1/ligand; SMA-2,SMA-3,sma-4/Smads,;的sma-6/receptor。我们的研究中,我们使用了两种不同的RNA干扰过敏C.的菌株进行实验:ERI-1 LIN-15B RRF-313,14。同时,我们也用N2(STAndard野生型)菌株和lin-36,LIN-15途径的RNA干扰的敏感性,但类似N2 13的一个组成部分。我们的研究结果显示( 图2),所有这些菌株如预期,显示短机身尺寸型(P <0.001),SMA-6 RNAi在LIN-36的背景。 RRF-3的背景,年轻的成年人RNAi治疗后体长分别为84%〜95%单独的载体。在ERI-1的LIN-15B背景的年轻人,体长RNAi后的68〜86%,对照组动物。相比的lin-36和N2菌株,两者的RNAi过敏性菌株RRF-3蓖麻-1;的lin-15b的更敏感。

图1
图1。代表图像的动物身体长度的测量。A.测量前动物形象;

图2
图2。 DBL-1通路组件已通过RNAi喂养方法灭活动物的体长。RNA干扰动物,所有这些背景株中显示短的车身长度预期的表型(P <0.001),除SMA-6 RNAi在LIN-36背景。 RNAi的RRF-3ERI-1-15B林株表现出了更强的表型的lin-36和N2背景。

图3
图3。原理图ðescription的,利用RNAi喂养策略,以筛选候选基因。

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Discussion

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在这个协议中,我们描述的车身尺寸有缺陷的突变体C.识别方法通过RNA干扰喂养的线虫 。此方法是适用于TGF-β信号分量的识别。由于这样的组件通过进化15是高度保守的,这样的屏幕是在所有后生动物阐明的分子机制的TGF-β信号有关。在这样的屏幕设计是一个重要的考虑出发菌株。我们已经证明,无论ERI-1,LIN-15bRRF-3更敏感的RNAi喂养比对照菌株,这与以往的研究12,13是一致的。然而,即使蓖麻-升;的lin-15b的表现出最强的表型,动物没有生长良好,并生产了少量的后代。因此,在一个大型的屏幕,我们不会有足够多的动物,得分从该菌株的表型。作为结果,我们主张RRF-3株申请RNA干扰喂养技术车身尺寸调节。考虑出发菌株的第二个选择是是否启动屏幕DBL-1通路完整或致敏株,其中DBL-1途径是妥协,或过度活跃的开始。这些可供选择的出发点都是可能导致的重叠,但不同的信号元件的识别。我们的协议也可以被修改,以研究其他胚后的表型。在这种情况下,感兴趣的表型的可得的动物的阶段,可能需要进行修改,通过改变在步骤2.5的增长的持续时间。启动其他表型的大型屏幕前,我们会建议试点屏幕产生兴趣的表型的基因,如我们在这里描述DBL-1,SMA-2,SMA-SMA-4SMA- 6。

通过使用此协议,撞倒DBL-1通路元件表现出预期的体长型。 Ţ软管RNA干扰动物与对照组动物相比,长度约68-95%。在以前的研究中,DBL-1通路失去功能的基因突变在成年缩短约50%,比野生型动物7,10,11。因此,这里介绍的供给的RNAi技术并没有完全消除基因的活性。因此,该方法可以被限制在其能力,以确定有一个弱的表型的通路的组件。同时,由于有许多基因,调节人体的长度,从屏幕上的基因也可能不一定下降DBL-1途径。进一步的实验应进行候选人的途径,是真正的任何其他屏幕的方法。

总之,RNAi技术的喂养屏幕C.线虫已被证明可用于确定在感兴趣的过程中所涉及的基因。在这个协议中,我们优化了现有协议的机身尺寸为缺陷的识别是非常有效的。可以进一步优化的协议修改为其他胚后的表型的研究。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢詹姆斯·C.克拉克为动物提供的数字,在不同的发育时间点。 菌株在这项研究中获得的秀丽隐杆线虫的遗传学中心,这是由美国国立卫生研究院国家研究资源中心(NCRR)的支持。这项工作是从纽约市立大学支持的CIRG 1817 JL和惩教署和美国国立卫生研究院1R15GM073678-01和1R15GM097692-01,惩教署,我们感谢William水稻博士,博士娜塔莉亚·霍尔茨曼,梅丽莎Silvestrini的手稿上的评论。这项工作是进行在部分履行一个博士学位研究生中心纽约市立大学(S.雄)“的要求。

Materials

RNAi worm plates
17.7 g Worm Medium Mix
60 g Agar
Add H2O to 3 liters. Autoclave.
Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes.

Worm plates

17.7 g Worm Medium Mix
0.6 g Streptomycin Sulfate
60 g Agar
Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes.

Worm Medium Mix
55 g Tris-Cl
24 g Tris-OH
310 g Bacto Peptone
800 mg Cholesterol
200 g NaCl
Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use.

2% agarose
0.5 g Agarose
Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved.

1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
2 g IPTG
Dissolve in10 ml dH2O

1M NaN3
6.5 g NaN3
Add dH2O to 100 ml

25 mM NaN3
2.5 ml 1M NaN3
Add dH2O to 100 ml

Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center
L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene)
Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16
60 mm Petri dishes
100 mm Petri dishes
14 ml round-bottom Falcon culture tubes
glass slides
glass coverslips
1-20 μl pipettor
20-200 μl pipettor
200-1000 μl pipettor
1-200 μl pipet tips
200-1000 μl pipet tips
1.5 ml Eppendorf tubes
platinum wire worm pick

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References

  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
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使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略<em&gt; C.线虫</em
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Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans. J. Vis. Exp. (72), e4373, doi:10.3791/4373 (2013).More

Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans. J. Vis. Exp. (72), e4373, doi:10.3791/4373 (2013).

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