Summary
हम प्रदर्शन कैसे आरएनएआई खिला तकनीक का उपयोग करने के लिए नीचे में लक्ष्य जीन और स्कोर शरीर के आकार के phenotype दस्तक
Abstract
डबल किनारा हस्तक्षेप आरएनए की मध्यस्थता (आरएनएआई) एक प्रभावी रणनीति के लिए नीचे लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 1-3 दस्तक है. यह संयंत्र अकशेरूकीय और रीढ़ सहित कई मॉडल प्रणाली को लागू किया गया है. 4,5 vivo में आरएनएआई को प्राप्त करने के विभिन्न तरीके हैं. उदाहरण के लिए, लक्ष्य जीन एक आरएनएआई वेक्टर के रूप में तब्दील किया जा सकता है, और फिर या तो स्थायी रूप से या transiently सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं जीन पछाड़ना प्रभाव को प्राप्त करने में तब्दील, वैकल्पिक रूप से विशिष्ट लक्ष्य जीन (आरएनएआई oligos) से डबल भूग्रस्त oligonucleotides संश्लेषित transiently हो सकता है सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को लक्ष्य जीन चुप्पी में तब्दील हो, या संश्लेषित डबल भूग्रस्त आरएनए अणुओं एक जीव में microinjected किया जा सकता है. चूंकि निमेटोड सी. एलिगेंस एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया का उपयोग करता है, बैक्टीरिया लक्ष्य जीन के खिलाफ डबल भूग्रस्त आरएनए व्यक्त के साथ पशुओं को खिला एक व्यवहार्य 6 रणनीति प्रदान करता है. यहाँ हम एक आरएनएआई खिला मौजूदविधि शरीर के आकार phenotype स्कोर करने के लिए. सी. में शारीरिक आकार एलिगेंस TGF-β द्वारा मुख्य रूप से नियंत्रित किया जाता है की तरह ligand DBL-1, तो इस परख TGF-बीटा संकेत 7 घटकों की पहचान के लिए उपयुक्त है. हम दो आरएनएआई अत्यंत अनुभुत आरएनएआई खिला प्रयोगों दोहराने उपभेदों सहित अलग अलग उपभेदों का इस्तेमाल किया. हमारे नतीजे बताते हैं कि तनाव rrf-3 हमें सबसे अच्छा उम्मीद आरएनएआई phenotype दिया. विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और आसानी से मात्रा निर्धारित है. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विशेष उपकरणों का उपयोग कम से कम है, तो यह छोटी प्रयोगशालाओं या मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में उन लोगों के लिए उपयुक्त है.
Protocol
1. आरएनएआई दूध पिलाने लक्ष्य जीन अनुक्रम उठाते प्लेट्स की तैयारी
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनएआई पुस्तकालयों (जैसे स्रोत बायोसाइंस जीव विज्ञान से) का उपयोग अगर, 1.4 कदम आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, मानक क्लोनिंग प्रोटोकॉल द्वारा L4440 वेक्टर, आमतौर पर इस्तेमाल किया आरएनएआई 8 प्लाज्मिड कीड़ा में लक्ष्य जीन दृश्यों क्लोन.
- बैक्टीरियल तनाव HT115 (DE3), लेग अगर प्लेटों पर उन्हें 25 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन के साथ संस्कृति और 12.5 ग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन में रीकॉम्बीनैंट प्लाज्मिड बदलना, और भविष्य में उपयोग के लिए एक एकल क्लोन उठाओ.
- इस बीच, बैक्टीरियल HT115 तनाव प्रयोगों के लिए एक नियंत्रण के रूप में उपयोग में खाली वेक्टर L4440 बदलना.
- संस्कृति दोनों रीकॉम्बीनैंट और खाली 37 पर 100 छ / मिलीलीटर एम्पीसिलीन रातोंरात के साथ एक मिलीलीटर लेग शोरबा डिग्री सेल्सियस में L4440 ले जीवाणुओं टेट्रासाइक्लिन तथ्य यह है कि यह आरएनएआई क्षमता कम हो जाती है की वजह से नहीं जोड़ा गया है.
- 100 ग्राम / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ रातोंरात cultu में एक और 5 मिलीग्राम लेग शोरबा जोड़ेंफिर, 37 पर एक और 4-6 घंटे के लिए सेते हैं ° सी.
- बीज 0.5 मिलीलीटर रीकॉम्बीनैंट या खाली L4440 ले जाने आरएनएआई कीड़ा प्लेटों पर बैक्टीरिया संस्कृति. क्लोन के नाम के साथ सभी प्लेटों लेबल.
- प्लेटों मार्क 37 पर रातोंरात सेते हैं ° C बैक्टीरियल लॉन बढ़ने, इन के साथ या बिना लक्ष्य जीन अनुक्रम आरएनएआई प्लेटें. कम से कम 2 प्लेटें प्रत्येक हालत के लिए तैयार किया जाना चाहिए.
2. आरएनएआई दूध पिलाने की प्लेट्स पर संस्कृति कीड़े
- ज्वाला एक प्लैटिनम तार कीड़ा लेने की नोक बाँझ. कीड़ा का उपयोग लेने के लिए लेने के लिए 6-10 4 लार्वा चरण (L4) प्रत्येक आरएनएआई थाली कि L4440 या तो पुनः संयोजक या खाली होता hermaphrodites, पशुओं के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया का उपयोग करेगा.
- Hermaphrodites 20 ° (सी. एलिगेंस के लिए एक मानक संस्कृति हालत) सी रातोंरात विकसित, वे युवा वयस्कों के अगले दिन हो जाएगा.
- एक नया तदनुसार लेबल और तैयार आरएनएआई थाली में 6-10 युवा वयस्कों स्थानांतरण.
- चलोवयस्कों के 4-6 घंटे के लिए अंडे देना है, तो थाली से सभी वयस्कों को निकालने के लिए, इस कदम के लिए संतान सिंक्रनाइज़ है. एक बार माताओं को हटा रहे हैं, समय गिनती शुरू करते हैं. इस समय शून्य है.
- 20 में प्लेटें सेते ° C जानवरों विशिष्ट विकास मंच विकसित करने के, इस प्रोटोकॉल में, हम प्ररूपी विश्लेषण के लिए युवा वयस्कों का चयन. Knockdowns है जो एक सामान्य दर पर विकसित करने के लिए, 72 घंटा ऊष्मायन युवा वयस्कों बनने जानवरों के लिए पर्याप्त है. हालांकि, विभिन्न जीनों पशु विकास अलग ढंग से प्रभावित करते हैं. यदि आरएनएआई जानवरों के लिए एक अलग दर पर बढ़ने का कारण बनता है, युवा वयस्कों L4 पिछले कोई और अधिक 24 से अधिक उन घंटा के रूप में किया जा सकता है पूरा vulval विकास और गर्भाशय में 2-6 भ्रूण (अगर उपजाऊ) के साथ की पहचान की. अन्य विकास के चरणों की पहचान, अन्वेषक gonadal और vulval विकास एक गाइड के रूप में उपयोग करना चाहिए.
3. आरएनएआई की कुल शारीरिक आकार phenotypes कीड़े व्यवहार
- एक गिलास स्लाइड पर रंग का लेबल टेप के दो परतों रखें. बनाने की दोसे गिलास स्लाइड. फिर, टेप के साथ दो स्लाइड्स के बीच में एक नया कांच स्लाइड जगह है. पानी में 2% agarose पिगलो, एक नए गिलास स्लाइड के केंद्र के लिए ड्रॉप लागू होते हैं, तो शीर्ष पर 2 गिलास स्लाइड प्रेस करने के लिए 2% agarose की एक पतली परत के रूप में 9 पहले से वर्णित है.
- एक बार agarose जम जाता है, शीर्ष गिलास स्लाइड निकालने के लिए, agarose पैड के साथ स्लाइड कीड़े को लोड करने के लिए तैयार है. क्लोन नाम के साथ लेबल स्लाइड.
- Agarose पैड से 10 μl 25 मिमी 3 NaN जोड़ें, NaN 3 समाधान में 30-40 जानवरों लेने के लिए उन्हें स्थिर करना, फिर शीर्ष पर coverslip डाल दिया, दोनों रीकॉम्बीनैंट और खाली आरएनएआई इलाज पशुओं L4440 ले जाने के लिए दोहराने.
- छवि विदारक खुर्दबीन के नीचे कीड़े 2.5x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर, यहाँ हम सॉफ्टवेयर Qcapture समर्थन के साथ Leica डिजिटल कैमरे का उपयोग.
- अंशांकन के लिए, पहले एक मानक सुक्ष्ममापी शासक की एक छवि पर कब्जा. फिर छवि प्रो सॉफ्टवेयर में छवि को खोलने के लिए, "उपाय" पर क्लिक करें और "अंशांकन" का चयन करें फिर चुनें"स्थानिक जादूगर अंशांकन". साथ चयनित "सक्रिय छवि जांचना", "अगले" पर क्लिक करें. इनपुट अंशांकन के लिए नाम और सुनिश्चित करें कि सुक्ष्ममापी स्थानिक संदर्भ इकाइयों को स्थापित कर रहे हैं. फिर, "बनाने के लिए एक संदर्भ अंशांकन" बटन की जाँच करें और "अगले" क्लिक करें. पर क्लिक करें "आकर्षित संदर्भ लाइन." एक संदर्भ पैमाने बार दिखाई देगा. पैमाने सुक्ष्ममापी छोर मैच बार reposition, तो संकेत मिलता है कि संदर्भ 1,000 इकाइयों को इंगित करता है. क्लिक करें "ठीक है", "अगला", और "समाप्त करें".
- एक बार सॉफ्टवेयर calibrated है, एक कीड़ा छवि को खोलने. फिर, "उपाय" मेनू के तहत चयन करने के लिए, "अंशांकन" का चयन करें तो पर "चयन स्थानिक" क्लिक करें. पुल डाउन मेनू में, सुक्ष्ममापी अंशांकन के लिए बनाई गई फ़ाइल नाम का चयन करें. फिर, "उपाय" मेनू के तहत, "माप." का चयन करें खिड़की में खुलता है, उपकरण मुफ्त आकर्षित का चयन करें और सिर से पशु शरीर के केंद्र के माध्यम से कंप्यूटर माउस (1 चित्रा) के साथ पूंछ एक लाइन का पता लगाने. लंबाई विंडो में सूचित किया जाएगा. अबलक्ष्य जीन आरएनएआई और नियंत्रण खाली L4440 वेक्टर के साथ पशुओं का इलाज के साथ इलाज के जानवरों के शरीर की लंबाई: आप डेटा के दो समूहों है.
- लंबाई माप एक Microsoft Excel फ़ाइल, या अन्य उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर निर्यात. प्रत्येक नमूने के लिए मतलब है और मानक विचलन की गणना से डेटा का विश्लेषण. तब छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर नमूने की तुलना करें.
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Representative Results
अपने शोध में, हम शरीर DBL-1/TGF-β मार्ग द्वारा विनियमन आकार पर ध्यान केंद्रित. DBL-1 छोटे शरीर के आकार में मार्ग परिणाम एक छोटी शरीर जंगली प्रकार 7,10,11 जानवरों के साथ तुलना में लंबाई सहित, के समारोह के नुकसान. सी. के लिए इस प्रकार, स्क्रीन एलिगेंस शरीर आकार म्यूटेंट TGF-बीटा संकेत घटकों और संशोधक की पहचान करने में सक्षम हैं. DBL 1 सिगनल TGF-बीटा एक संरक्षित संकेत पारगमन मार्ग है कि कोशिका की सतह रिसेप्टर्स और intracellular Smad संकेत 12 transducers शामिल द्वारा मध्यस्थता है. शरीर के आकार म्यूटेंट की पहचान के लिए खिला द्वारा आरएनएआई के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हम इस तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए नीचे DBL-1 मार्ग घटकों दस्तक: dbl-1/ligand, sma-2, sma-3 sma-4/Smads, और sma-6/receptor हमारे अध्ययन के लिए, हम दो अलग आरएनएआई अत्यंत अनुभुत सी. एलिगेंस प्रयोग उपभेदों: eri-1, लिन-15b और 13,14 rrf-3. इस बीच, हम भी N2 इस्तेमाल किया (स्टेशनndard जंगली प्रकार) तनाव और लिन-36, लिन-15 मार्ग आरएनएआई जिसका संवेदनशीलता फिर भी 13 N2 के समान है में एक घटक है. हमारे परिणाम (2 चित्रा) पता चलता है कि इन सभी उपभेदों के कम शरीर के आकार phenotype प्रदर्शित (पी 0.001 <) के रूप में sma-6 लिन 36-पृष्ठभूमि में आरएनएआई को छोड़कर, उम्मीद. पृष्ठभूमि में rrf-3, आरएनएआई इलाज के बाद युवा वयस्कों के शरीर की लंबाई 84 ~ अकेले वेक्टर के 95% थे. इरी-1, लिन 15b पृष्ठभूमि, युवा वयस्कों के शरीर की लंबाई के बाद आरएनएआई नियंत्रण जानवरों के 68 ~ 86% थे. लिन 15b अधिक संवेदनशील थे, लिन-36 और N2 उपभेदों, आरएनएआई अत्यंत अनुभुत उपभेदों rrf-3 और इरी-1 के दोनों के साथ तुलना.
चित्रा 1. पशु शरीर की लंबाई के प्रतिनिधि छवियों मापा जा रहा है, ए पशु माप से पहले छवि.
चित्रा 2. जानवरों में DBL-1 मार्ग घटकों आरएनएआई खिला विधि द्वारा किया गया निष्क्रिय है शरीर की लंबाई इन पृष्ठभूमि उपभेदों के सभी में आरएनएआई जानवरों उम्मीद (पी 0.001 <) के रूप में sma-6 लिन-36 में आरएनएआई को छोड़कर कम शरीर की लंबाई phenotype, प्रदर्शित पृष्ठभूमि. आरएनएआई rrf-3 और इरी-1, लिन-15b उपभेदों कि लिन-36 और N2 पृष्ठभूमि की तुलना में एक मजबूत phenotype प्रदर्शन किया.
चित्रा 3. योजनाबद्ध घआरएनएआई खिला रणनीति का उपयोग करने के लिए उम्मीदवार जीनों के लिए स्क्रीन की escription.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम शरीर सी. के आकार दोषपूर्ण म्यूटेंट के पहचान के लिए हमारे विधि का वर्णन आरएनएआई खिला द्वारा एलिगेंस. इस विधि TGF-बीटा संकेत घटकों की पहचान करने के लिए लागू है. चूंकि ऐसे घटकों अत्यधिक विकास 15 के माध्यम से संरक्षित कर रहे हैं, इस तरह के स्क्रीन सभी मेटाजोअन में TGF-बीटा संकेतन के आणविक तंत्र elucidating के लिए प्रासंगिक हैं. इस स्क्रीन को डिजाइन करने में एक महत्वपूर्ण विचार शुरू तनाव है. हमने दिखा दिया है कि दोनों eri-1, लिन 15b और rrf-3 अधिक नियंत्रण उपभेदों, जो पिछले 12,13 अध्ययन के साथ संगत है, की तुलना में आरएनएआई खिलाने के लिए संवेदनशील हैं. बहरहाल, भले ही इरी - एल, लिन-15b मजबूत phenotype प्रदर्शन किया, जानवरों अच्छी तरह से नहीं बढ़ने और कुछ संतान का उत्पादन किया. इस प्रकार, एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन में, हम पर्याप्त जानवरों इस तनाव से phenotypes स्कोरिंग के लिए नहीं करना होगा. नतीजतन, हम rrf तीन तनाव लागू करने के लिए एहसानआरएनएआई भोजन शरीर के आकार के विनियमन के लिए तकनीक. शुरू तनाव में विचार करने के लिए एक दूसरा विकल्प यह है कि क्या DBL-1 बरकरार मार्ग के साथ स्क्रीन को आरंभ करने के लिए या एक अवगत तनाव DBL-1 में जो मार्ग या समझौता किया है अति के साथ शुरू. इन वैकल्पिक शुरू अंक की पहचान अतिव्यापी लेकिन संकेत घटकों के अलग सेट करने के लिए नेतृत्व करने की संभावना है. हमारा प्रोटोकॉल भी अन्य postembryonic phenotypes का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस मामले में, ब्याज की phenotype के लिए बनाए जा जानवरों के चरण के लिए 2.5 चरण में विकास की अवधि बदलकर संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. अन्य phenotypes के लिए एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन की शुरुआत से पहले, हम ब्याज की phenotype उत्पादन ज्ञात जीन के साथ एक पायलट स्क्रीन की सिफारिश जैसे हम dbl-1, SMA-2, sma sma-3-4, और sma के लिए यहाँ का वर्णन 6.
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, नीचे दस्तक DBL-1 मार्ग घटकों उम्मीद शरीर की लंबाई phenotype दिखाया. टीनली आरएनएआई जानवरों नियंत्रण जानवरों के साथ तुलना में लंबाई में 68-95% के बारे में थे. पिछले अध्ययनों में, DBL-1 वयस्कता में समारोह आनुवंशिक म्यूटेंट के मार्ग नुकसान के बारे में 50% जंगली प्रकार 7,10,11 जानवरों की तुलना में कम कर रहे हैं. इसलिए, आरएनएआई खिला यहाँ प्रस्तुत तकनीक पूरी तरह से जीन गतिविधि को समाप्त नहीं किया था. इस प्रकार, विधि इसके लिए मार्ग घटक है कि एक कमजोर phenotype की पहचान करने की क्षमता में सीमित हो सकता है. इस बीच, के बाद से वहाँ कई जीन है कि शरीर की लंबाई को नियंत्रित कर रहे हैं, तो स्क्रीन से जीन की पहचान भी जरूरी DBL 1-मार्ग में नहीं गिर सकता है. आगे के प्रयोगों के लिए रास्ते में उम्मीदवारों जगह किया जाना चाहिए, के रूप में किसी भी अन्य स्क्रीन पद्धति के लिए सच है.
सारांश में सी. में आरएनएआई खिला स्क्रीन एलिगेंस ब्याज की एक प्रक्रिया में शामिल जीन की पहचान करने में उपयोगी साबित किया है. इस प्रोटोकॉल में, हम मौजूदा प्रोटोकॉल अनुकूलित है शरीर के आकार के दोषों की पहचान करने में अत्यधिक प्रभावी हो. अनुकूलित प्रोटोकॉल आगे हो सकता हैअन्य postembryonic phenotypes का अध्ययन के लिए संशोधित.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम विभिन्न विकासात्मक समय अंक पर पशुओं के आंकड़े उपलब्ध कराने के लिए जेम्स क्लार्क सी. धन्यवाद. इस अध्ययन में एलिगेंस उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा समर्थित है से प्राप्त किया गया. यह काम 1817 CIRG CUNY से जीएल और सीएसडी समर्थित किया गया था, और NIH 1R15GM073678-01 और सीएसडी के लिए 1R15GM097692-01 के द्वारा हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए डॉ. विलियम जे चावल, डॉ. Nathalia Holtzman, और मेलिस्सा Silvestrini धन्यवाद. न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय (एस Xiong) के ग्रेजुएट केंद्र से पीएचडी की डिग्री के लिए आवश्यकताओं की आंशिक पूर्ति में इस काम से बाहर किया गया था.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
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