Summary
Vi viser hvordan du bruker RNAi fôring teknikk for å slå ned målgener og score kroppsstørrelse fenotype i
Abstract
Double-strand RNA-mediert interferens (RNAi) er en effektiv strategi for å slå ned målet genuttrykk 1-3. Det har blitt brukt til mange modell systemer, inkludert planter, dyr og virveldyr. Det finnes ulike metoder for å oppnå RNAi in vivo 4,5. For eksempel kan målgenet bli transformert til en RNAi vektor, og deretter enten permanent eller forbigående forvandlet til cellelinjer eller primære celler for å oppnå genet knockdown effekter, alternativt syntetisert dobbelt-strand oligonukleotider fra bestemte målgener (RNAi oligoer) kan være forbigående forvandlet til cellelinjer og primære celler for å slå målgener, eller syntetisert dobbel tråd RNA-molekyler kan microinjected i en organisme. Siden nematode C. elegans bruker bakterier som matkilde, mate dyr med bakterier uttrykker dobbel tråd RNA mot målgener gir en levedyktig strategi 6. Her presenterer vi en RNAi fôringmetode å score kroppsstørrelse fenotype. Kroppsstørrelse i C. elegans reguleres primært ved TGF-β - som ligand DBL-1, slik at denne analysen er hensiktsmessig for identifisering av TGF-β signalnettverk komponenter 7. Vi brukte forskjellige stammer inkludert to RNAi hypersensitive stammer å gjenta RNAi fôring eksperimenter. Våre resultater viste at RRF-3 belastning ga oss den beste forventede RNAi fenotype. Metoden er enkel å utføre, reproduserbar, og lett kvantifisert. Videre reduserer vår protokoll bruk av spesialisert utstyr, så det er egnet for mindre laboratorier eller de på hovedsakelig lavere institusjoner.
Protocol
1. Forbereder RNAi Feeding Plater Bære Target Gene Sequence
- Hvis du bruker kommersielt tilgjengelige RNAi bibliotekene (f.eks fra Source BioScience LifeSciences), går du til trinn 1.4. Alternativt klone target gensekvenser i L4440 vektor, en vanlig orm RNAi plasmid 8, etter standard kloning protokoll.
- Transformere rekombinant plasmid inn bakteriestammen HT115 (DE3), kultur dem på LB agarplater med 25 ug / ml Carbenicillin og 12,5 ug / ml tetracyklin, og velge en enkelt klon for fremtidig bruk.
- I mellomtiden transformere den tomme vektor L4440 inn bakteriestammen HT115 å bruke som en kontroll for eksperimentene.
- Kultur både rekombinante og tom L4440-bærer bakterier i 1 ml LB-næringsløsning med 100 ug / ml ampicillin over natten ved 37 ° C. Tetracyclin er ikke lagt grunnet det faktum at det reduserer RNAi effektivitet.
- Legge til en annen 5 ml LB-næringsløsning med 100 ug / ml ampicillin i det over natten culture, inkuberes i en annen 4-6 timer ved 37 ° C.
- Seed 0,5 ml rekombinant eller tom L4440-bærer bakteriekultur på de RNAi ormen platene. Merke alle platene med klone navn.
- Marker platene og inkuber over natten ved 37 ° C for å dyrke bakteriell plen, og disse er de RNAi plater med eller uten target gensekvensen. Minst to plater bør være forberedt for hver tilstand.
2. Kultur Worms på RNAi Feeding Plates
- Flame sterilisere spissen av en platinatråd orm hakke. Bruk ormen plukke å plukke 6-10 fjerde larvestadiet (L4) hermafroditter til hver RNAi plate som inneholder enten rekombinant eller tom L4440, dyrene vil bruke bakterier som matkilde.
- La hermafroditter vokse ved 20 ° C (en standard kultur forutsetning for C. elegans) over natten, vil de bli unge voksne neste dag.
- Overfør 6-10 unge voksne inn i en ny tilsvarende merket og forberedt RNAi plate.
- Lavoksne legger egg for 4-6 time, deretter fjerne alle voksne fra platen, dette trinnet er å synkronisere avkommet. Når mødrene er fjernet, begynner å telle tid. Dette er tid null.
- Inkuber platene ved 20 ° C for å la dyr vokse til bestemte utviklingsstadiet, i denne protokollen, velger vi unge voksne for fenotypeanalyser. For nedslaging som utvikler i normal hastighet, er 72 timers inkubasjon tilstrekkelig for dyr å bli unge voksne. Men ulike gener påvirker dyr utvikling annerledes. Hvis RNAi fører dyrene å vokse på en annen kurs, kan unge voksne identifiseres som de ikke mer enn 24 timer tidligere L4 med fullført vulval utvikling og 2-6 embryoer i livmoren (hvis fruktbar). Å identifisere andre utviklingsstadier, bør etterforskeren bruke gonadal og vulval utvikling som en veiledning.
3. Poengsum kroppsstørrelse fenotyper av RNAi Behandlet Worms
- Plasser to lag med farget etikett bånd på et glass lysbilde. Lag to avSE glassplater. Deretter plasserer et nytt glass lysbilde i mellom de to lysbilder med tape. Smelt 2% agarose i vann; bruke en dråpe til sentrum av den nye glass lysbilde, deretter på den andre glass-slide på toppen for å lage et tynt lag av 2% agarose som beskrevet tidligere 9.
- Når agarose er størknet, fjerne det øverste glass slide, slide med agarose pad er klar til å laste ormer. Etiketten lysbilde med klone navn.
- Tilsett 10 pl 25 mM NaN 3 til agarose pad, plukke 30-40 dyr i NaN 3 løsning for å immobilisere dem, og deretter sette dekkglass på toppen, gjenta for både rekombinant og tomme L4440-bærer RNAi-behandlede dyr.
- Bilde ormer henhold disseksjonsmikroskop med 2.5x objektiv, her bruker vi Leica digital kamera med støtte programvare Qcapture.
- For kalibrering, først ta et bilde av en standard mikrometer linjal. Deretter åpner du bildet i Image-Pro, Klikk på "mål" og velg "kalibrering" og velg"Romlig kalibrering wizard". Med "kalibrere det aktive bildet" er valgt, klikk på "neste". Skriv inn navnet for kalibrering og sørge for at de romlige referanse enhetene er satt til mikrometer. Deretter sjekke "opprette en referanse kalibrering"-knappen, og klikk "neste". Klikk på "draw referanse linje." En referanse skala vil vises. Reposisjonere målestokken for å matche endene av mikrometer, i så fall at referansen indikerer 1000 enheter. Klikk "OK", "Next", og "Finish".
- Når programvaren er kalibrert, åpner en orm bilde. Deretter velger under "mål"-menyen, velg "kalibrering" og deretter klikke på "select romlig". I rullegardinmenyen, velg filnavnet opprettet for mikrometer kalibrering. Deretter, under "mål"-menyen, velg "målinger". I vinduet som åpnes, velg fritt trekke verktøy og spore en linje gjennom sentrum av dyret kroppen fra hode til hale med datamus (figur 1). Lengden vil bli rapportert i vinduet. Nådu har to grupper av data: kroppslengde av dyr behandlet med målgenet RNAi og kontrolldyr behandlet med tomme L4440 vektor.
- Eksporter lengdemåling til et Microsoft Excel-fil, eller annet egnet statistisk programvare. Analysere dataene ved å beregne gjennomsnitt og standardavvik for hver prøve. Deretter sammenligne prøvene med Student t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår forskning har vi fokus på kroppsstørrelse regulering av DBL-1/TGF-β veien. Tap av funksjon av DBL-1 bane resulterer i liten kroppsstørrelse, inkludert en kortere kroppslengde sammenlignet med vill-type dyr 7,10,11. Dermed skjermer for C. elegans kroppsstørrelse mutanter er i stand til å identifisere TGF-β signalering komponenter og modifikatorer. DBL-1 signalering er mediert av et konservert TGF-β signaltransduksjon sti som inkluderer celleoverflatereseptorer og intracellulære Smad signal svingere 12. For å teste effektiviteten av RNAi av fôring for identifisering av kroppsstørrelse mutanter, brukte vi denne teknikken til å slå ned DBL-1 pathway komponenter: dbl-1/ligand; sma-2, sma-3, sma-4/Smads, og sma-6/receptor. For vår studie har vi brukt to forskjellige RNAi overfølsom C. elegans stammer å utføre eksperimentet: Eri-1; lin-15b og RRF-3 13,14. I mellomtiden har vi også brukt N2 (standard villtype) stamme og lin-36, en komponent i lin-15 sti som RNAi følsomhet er likevel lik N2 13. Våre resultater (fig. 2) viser at alle disse stammene viste kort kroppsstørrelse fenotype som forventet (p <0,001), bortsett SMA-6 RNAi i lin-36 bakgrunn. I RRF-3 bakgrunn, var karosserilengder av unge voksne etter RNAi behandling 84 ~ 95% av vektor alene. I Eri-1, lin-15b bakgrunn, karosserilengder av unge voksne etter RNAi var 68 ~ 86% av kontroll dyr. Sammenlignet med lin-36 og N2 stammer, både av RNAi overfølsom stammer RRF-3 og eri-1, lin-15b var mer følsom.
Figur 1. Representative bilder av dyr kroppslengde blir målt A. dyr bilde før måling.;
Figur 2. Kroppslengde på dyr der DBL-1 pathway komponenter har blitt inaktivert av RNAi fôring metode. RNAi dyr i alle disse bakgrunnen stammer vises kort kroppslengde fenotype som forventet (p <0,001), med unntak av sma-6 RNAi i lin-36 bakgrunn. RNAi av RRF-3 og eri-1, lin-15b stammer viste en sterkere fenotype enn lin-36 og N2 bakgrunn.
Figur 3. Skjematisk description å bruke RNAi fôring strategi for å skjerme for kandidatgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, beskriver vi vår metode for identifisering av kroppsstørrelse defekte mutanter av C. elegans av RNAi fôring. Denne metoden kan anvendes til identifisering av TGF-β signalveier komponenter. Siden slike komponenter er svært konservert gjennom evolusjonen 15, slike skjermer er relevante for å belyse de molekylære mekanismene for TGF-β signalering i alle metazoans. Et viktig hensyn i utformingen slik skjerm er utgangspunktet belastningen. Vi har vist at både Eri-1, lin-15b og RRF-3 er mer følsomme for RNAi fôring enn kontrollstammer, som er konsistent med tidligere studier 12,13. Men selv om Eri-l; lin-15b demonstrerte sterkeste fenotype, gjorde dyrene ikke vokser godt og produsert noen avkom. Derfor, i en storstilt skjerm, ville vi ikke ha nok dyr for scoring fenotyper fra denne belastningen. Som et resultat, favorisere vi RRF-3 belastning å påføreRNAi fôring teknikk til kroppsstørrelse regulering. En annen valg å vurdere i startelleveren belastningen er om å starte en skjerm med DBL-1 sti intakt eller å begynne med et sensitivisert belastning der DBL-1 veien er enten utsatt eller overaktiv. Disse alternative startpunkter vil sannsynligvis føre til identifisering av overlappende, men distinkte sett signaliserer komponenter. Vår protokollen kan også modifiseres til studiet av andre postembryonic fenotyper. I dette tilfellet, kan fasen av de dyr som skal scoret for fenotypen av interesse må endres ved å endre varigheten av veksten i trinn 2.5. Før oppstart av en stor skala skjerm for andre fenotyper, vil vi anbefale en pilot skjerm med gener kjent for å produsere fenotypen av interesse som vi beskriver her for dbl-1, sma-2, sma-3 sma-4, og sma- 6.
Ved å bruke denne protokollen, slå ned DBL-1 bane komponenter viste forventet kroppslengde fenotype. Tslange RNAi dyr var ca 68-95% i lengde sammenlignet med kontrollgruppen dyr. I tidligere studier, DBL-1 pathway tap av funksjon genetiske mutanter i voksen alder er ca 50% kortere enn vill type dyr 7,10,11. Derfor gjorde RNAi fôring teknikken som presenteres her ikke fullt eliminere genaktivitet. Således kan fremgangsmåten være begrenset i sin evne til å identifisere pathway komponenter som har en svak fenotype. I mellomtiden, siden det er mange gener som regulerer kroppens lengde, gener identifisert fra skjermen også kanskje ikke nødvendigvis faller i DBL-1 sti. Ytterligere eksperimenter bør utføres for å plassere kandidater i traseer, som er sant for en annen skjerm metode.
I sammendraget, RNAi fôring skjermer i C. elegans har vist seg nyttig for å identifisere gener som er involvert i en prosess av interesse. I denne protokollen, har vi optimalisert eksisterende protokoller for å være svært effektiv i identifisering av kroppsstørrelse defekter. Den optimaliserte protokollen kan bli ytterligeremodifisert for studiet av andre postembryonic fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker James Clark for å gi tall av dyr på ulike utviklingsforstyrrelser tidspunkter. C. elegans stammer i denne studien er hentet fra Caenorhabditis Genetics Center, som er støttet av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbeidet ble støttet av CIRG 1817 fra CUNY til JL og CSD, og ved NIH 1R15GM073678-01 og 1R15GM097692-01 til CSD Vi takker Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman, og Melissa Silvestrini for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble utført i delvis oppfyllelse av kravene til en doktorgrad fra Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
