Summary
Мы продемонстрируем, как использовать технику RNAi кормления, чтобы сбить генов-мишеней и оценка размеров тела фенотип
Abstract
Двухцепочечной РНК-опосредованного вмешательства (RNAi) является эффективной стратегией, чтобы сбить цель экспрессии гена 1-3. Это была применена для многих модельных систем, включая растения, беспозвоночных и позвоночных животных. Существуют различные методы для достижения RNAi в естественных 4,5. Например, ген-мишень может быть преобразована в векторе RNAi, а затем постоянно или временно превращаются в клеточные линии, или первичные элементы для достижения эффекта гена нокдаун, можно также синтезировать двунитевых олигонуклеотидов от специфических генов-мишеней (RNAi олигонуклеотиды) может быть временно превращаются в клеточные линии или первичные клетки, чтобы заставить замолчать гены-мишени, или синтезированные двухцепочечной молекулы РНК могут быть микроинъекции в организм. Так как нематоды C. Элеганс используется бактериями как источник пищи, кормление животных с бактериями, выразив двухцепочечной РНК против генов-мишеней обеспечивает жизнеспособную стратегию 6. Здесь мы представляем кормления RNAiМетод забить фенотип размера тела. Размер тела в C. Элеганс регулируется, прежде всего, TGF-β - как лиганд DBL-1, так что этот тест подходит для идентификации TGF-β сигнализации компоненты 7. Мы использовали различные штаммы в том числе два RNAi гиперчувствительной штаммов, чтобы повторить эксперименты RNAi кормления. Наши результаты показали, что СБР-3 штамма дали нам лучшее ожидаемый фенотип RNAi. Метод прост для выполнения, воспроизводимые и легко поддаются количественной оценке. Кроме того, наш протокол сводит к минимуму использование специализированного оборудования, поэтому она подходит для небольших лабораторий или те, в основном студентов учреждений.
Protocol
1. Подготовка RNAi кормления Плиты Проведение последовательности гена-мишени
- При использовании коммерчески доступных RNAi библиотеки (например, от источника BioScience Lifesciences), переходите к шагу 1.4. Кроме того, клонирование последовательности целевого гена в вектор L4440, обычно используемые червем RNAi плазмиды 8, по стандартному протоколу клонирования.
- Преобразование рекомбинантной плазмиды в бактериальном штамме HT115 (DE3), культуру их на пластинах LB агар с 25 мкг / мл карбенициллин и 12,5 мкг / мл тетрациклина, и выбрать одного клона для использования в будущем.
- Между тем, преобразовать пустые L4440 вектор в бактериальном штамме HT115 для использования в качестве контроля для экспериментов.
- Культура и рекомбинантные и пустые L4440 несущих бактерий в 1 мл бульона LB с 100 мкг / мл ампициллина в течение ночи при 37 ° C. Тетрациклин не добавил в связи с тем, что она снижает эффективность РНК-интерференции.
- Добавить еще 5 мл LB бульоне с 100 мкг / мл ампициллина в ночь cultuповторно, инкубировать в течение еще 4-6 ч при 37 ° C.
- Семенной 0,5 мл рекомбинантного или пустой L4440 несущих бактериальной культуры на пластинах RNAi червей. Этикетка все пластины с клоном имя.
- Отметить пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° C рост бактериальных газонов; эти RNAi пластины с или без целевой последовательности гена. По крайней мере, 2 пластины должны быть подготовлены для каждого условия.
2. Культура червей на пластинах RNAi кормления
- Пламя стерилизации кончик червя выбор платиновой проволоки. Используйте червя выбрать, чтобы подобрать 6-10 четвёртую личиночной стадии (L4) гермафродиты на каждой пластине РНК-интерференции, который содержит либо рекомбинантные или пустой L4440, животные будут использовать бактерии в качестве источника пищи.
- Пусть гермафродиты расти при 20 ° C (стандартное условие культуры C. Элеганс) в течение ночи, они станут молодые люди на следующий день.
- Передача 6-10 молодых людей в новую соответственно промаркированы и подготовлены пластины RNAi.
- ПустьВзрослые откладывают яйца в течение 4-6 ч, затем удалить все взрослые от пластины; этот шаг, чтобы синхронизировать потомства. Как только матерям будут удалены, начинают отсчитывать время. Это время нуля.
- Инкубируйте пластины при температуре 20 ° C, чтобы животные растут конкретные стадии развития, и в этом протоколе, мы выбираем молодых людей для фенотипического анализа. Для нокдаунов, которые развиваются на нормальной скорости, 72 ч инкубации является достаточным для животных, чтобы стать молодые люди. Тем не менее, различные гены влияют на развитие животных по-разному. Если RNAi вызывает животные расти с разной скоростью, молодые люди могут быть определены как те, не более 24 часов с прошлым L4 завершена разработка и вульвы 2-6 эмбрионов в матку (если плодородный). Для выявления других стадиях развития, следователь должен использовать половых и вульвы развития в качестве ориентира.
3. Оценка Размер тела Фенотипы RNAi Обработанные черви
- Поместите два слоя цветного ленты этикетки на стекле. Сделайте дваслайды себе стекло. Затем поместите новое предметное стекло между двумя слайдами с лентой. Растопить 2% агарозном в воде; применять одну каплю в центре нового предметное стекло, а затем нажмите вторую предметное стекло на верхней, чтобы сделать тонким слоем 2% агарозном как описано выше 9.
- После агарозном затвердевает, снимите верхнюю предметное стекло, стекло с агарозном площадка готова для загрузки червей. Этикетка слайд с названием клон.
- Добавить 10 мкл 25 мМ NaN 3 в агарозном площадку, возьмите 30-40 животных в NaN 3 решения, чтобы обездвижить их, затем положить покровное на вершине; повтора как для рекомбинантного и пустые L4440 несущих RNAi-обработанных животных.
- Изображение червей под рассекает микроскопом, используя 2.5x объектив, здесь мы используем Leica цифровой камеры с поддержкой программного обеспечения Qcapture.
- Для калибровки, в первую захвата изображения стандартной линейки микрометра. Затем откройте изображение в Image-Pro программного обеспечения, нажмите на "мера" и выберите "калибровка" выберите"Пространственной мастер калибровки". С "Калибровка активного образа" выбраны, нажмите на кнопку "Далее". Введите имя для калибровки и убедиться, что пространственные единицы ссылкой установлены на микрометр. Затем проверьте, "создать ссылку калибровка" и нажмите кнопку "Далее". Нажмите на "опорной линии ничья". Бар ссылкой шкале появится. Переместите шкалы в соответствии с концами микрометр, то указать, что ссылка указывает 1000 единиц. Нажмите "OK", "Next" и "Finish".
- После того как программа откалибровать, открыть червь изображения. Затем выберите в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "калибровка", а затем нажмите на кнопку "Выбрать пространственные". В выпадающем меню выберите имя файла создается для калибровки микрометров. Затем, в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "измерений". В открывшемся окне выберите свободно рисовать инструментом и проследить линию через центр тела животного от головы до хвоста с компьютерной мыши (рис. 1). Длина будут представлены в окне. Сейчасу вас есть две группы данных: длина тела животных, получавших целевого гена РНК-интерференции и контроля животных, получавших с пустыми L4440 вектор.
- Экспорт измерения длины в файл Microsoft Excel или другого подходящего статистического программного обеспечения. Анализ данных путем вычисления среднего значения и стандартного отклонения для каждого образца. Затем сравнить образцы с использованием Стьюдента-тест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем исследовании мы ориентируемся на размер тела регулирования DBL-1/TGF-β пути. Потеря функции DBL-1 путей приводит к небольшим размером тела, в том числе короче длины тела по сравнению с диким типом животных 7,10,11. Таким образом, экраны для C. Элеганс мутантов размером тела способны выявлять TGF-β сигнализации компоненты и модификаторы. DBL-1 сигнализации опосредовано консервативных TGF-β пути передачи сигнала, которая включает клеточной поверхности рецепторов и внутриклеточных Smad преобразователи сигнала 12. Чтобы проверить эффективность РНК-интерференции путем подачи для идентификации мутантов размером тела, мы использовали эту технику, чтобы сбить DBL-1 путь компонентов: dbl-1/ligand; SMA-2, SMA-3, sma-4/Smads и sma-6/receptor. Для нашего исследования мы использовали два различных RNAi гиперчувствительной C. Элеганс штаммов для проведения эксперимента: эри-1; лин-15b и СБР-3 13,14. Между тем, мы также использовали N2 (STAndard дикий тип), деформации и лин-36, составляющая в лин-15 путем РНК-интерференции которых чувствительность, тем не менее похожи на N2 13. Наши результаты (рис. 2) показывают, что все эти штаммы отображаются короткие фенотип размер тела, как ожидалось (р <0,001), за исключением SMA-6 RNAi в лин-36 фона. В СБР-3 фона, длина тела молодых людей после лечения RNAi было 84 ~ 95% вектор в одиночку. В эри-1; лин-15b фон, тело длиной молодых людей после того, как РНК-интерференции были 68 ~ 86% от контрольных животных. По сравнению с лин-36 и N2 штаммов, каждый из RNAi гиперчувствительной штаммов СБР-3 и эри-1; лин-15b были более чувствительны.
Рисунок 1. Представитель изображениями животных длина тела измеряется А. изображение животного перед измерением.
Рисунок 2. Длина тела животных, в которых DBL-1 путем компоненты были инактивируется метод кормления RNAi. RNAi животных во всех этих штаммов фоне изображена короткая длина тела фенотип, как ожидалось (р <0,001), за исключением SMA-6 RNAi в лин-36 фон. RNAi СБР-3 и эри-1; лин-15b штаммов показал более сильный фенотип, чем лин-36 и N2 фон.
Рисунок 3. Схема Description использовании RNAi кормления стратегии для выявления генов-кандидатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы описываем наш метод для определения размера тела дефектных мутантов C. Элеганс от кормления RNAi. Этот метод применим для выявления TGF-β компоненты сигнализации. Поскольку такие компоненты высоко консервативны в процессе эволюции 15, такие экраны имеют отношение к выяснению молекулярных механизмов TGF-β сигнализации во всех многоклеточных. Важным фактором при проектировании такой экран является исходным штаммом. Мы показали, что оба эри-1; лин-15b и СБР-3 являются более чувствительными к кормлению RNAi, чем контрольные штаммы, что согласуется с предыдущими исследованиями 12,13. Однако, несмотря на эри-л; лин-15b продемонстрировали сильнейший фенотип, животные не хорошо растут и производятся несколько потомства. Таким образом, в больших масштабах экран, мы не имели бы достаточно для озвучивания животных фенотипа от этого штамма. В результате, мы выступаем за СБР-3 штамма, чтобы применитьRNAi кормления технику к телу регулирования размера. Второй вариант рассмотреть в исходного штамма заключается в том, чтобы инициировать экран с DBL-1 путем нетронутыми или начать с чувствительным штаммом, в котором DBL-1 путем либо скомпрометированы или гиперактивность. Эти альтернативные отправной точкой, скорее всего, приведет к выявлению пересекающихся, но различные наборы сигнальных компонентов. Наш протокол также может быть изменена к изучению других постэмбрионального фенотипов. В этом случае этап животных, которые будут забил за фенотип интерес, возможно, должны быть модифицированы путем изменения длительности роста в шаге 2.5. До начала большой экран шкалу для других фенотипы, мы рекомендовали бы пилот экран с генами, как известно, производят фенотип интереса, таких как мы описываем здесь DBL-1, SMA-2, SMA-3 SMA-4 и SMA- 6.
С помощью этого протокола, сбивая DBL-1 компоненты путь показал, ожидается фенотип длины тела. TШланг RNAi животных было около 68-95% в длине по сравнению с контрольными животными. В предыдущих исследованиях, DBL-1 путем потери функции генетических мутантов в зрелом возрасте примерно на 50% короче, чем у животных дикого типа 7,10,11. Таким образом, метод РНК-интерференции кормления, представленные здесь, не полностью устранить генной активности. Таким образом, метод может быть ограничен в своей способности идентифицировать путь компонентов, которые имеют слабый фенотип. Между тем, поскольку есть много генов, которые регулируют длину тела, гены определены с экрана также не обязательно попадают в DBL-1 путь. Дальнейшие эксперименты должны быть выполнены, чтобы разместить кандидатов в пути, как это верно для любой другой метод экране.
Таким образом, RNAi кормления экраны в C. Элеганс оказались полезными для выявления генов, вовлеченных в процесс интерес. В этом протоколе, мы оптимизировали существующие протоколы свою высокую эффективность в выявлении дефектов размера тела. Оптимизированный протокол может быть дополнительномодифицирован для изучения других постэмбрионального фенотипов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Джеймса Кларка для обеспечения фигурки животных в различные моменты времени развития. C. Элеганс штаммов в этом исследовании, были получены из Caenorhabditis генетический центр, который поддерживается NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Эта работа была поддержана CIRG 1817 от CUNY, чтобы JL и CSD, а также путем NIH 1R15GM073678-01 и 1R15GM097692-01 до CSD Мы благодарим д-р Уильям Дж. Райс, д-р Наталья Хольцман, и Мелисса Сильвестрини замечания по рукописи. Эта работа была проведена в частичное выполнение требований к степени кандидата наук в Высшей центра Городского университета Нью-Йорка (С. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
