Summary
Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del cuerpo
Abstract
Haga doble cadena de ARN mediada por interferencia (ARNi) es una estrategia efectiva para derribar objetivo de la expresión génica 1-3. Se ha aplicado a muchos sistemas modelo incluyendo plantas, invertebrados y vertebrados. Hay varios métodos para lograr la RNAi in vivo 4,5. Por ejemplo, el gen diana puede ser transformado en un vector de ARNi, y a continuación, ya sea permanentemente o transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias para lograr los efectos de genes desmontables; alternativamente sintetizarse oligonucleótidos de doble cadena a partir de genes diana específicos (RNAi oligos) puede ser transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias de silenciar genes diana, o sintetizado de doble filamento moléculas de ARN puede microinyectarse en un organismo. Desde el nematodo C. elegans utiliza bacterias como fuente de alimento, la alimentación de los animales con bacterias que expresan ARN de cadena doble contra genes diana proporciona una estrategia viable 6. A continuación les presentamos una alimentación RNAimétodo de anotar el tamaño del cuerpo fenotipo. Tamaño del cuerpo en C. elegans está regulada principalmente por el TGF-β - ligando como DBL-1, por lo que este método es apropiado para la identificación de TGF-β componentes de señalización 7. Utilizamos diferentes cepas incluyendo dos cepas RNAi hipersensibilidad a repetir los experimentos de alimentación RNAi. Nuestros resultados mostraron que la FRR-3 cepa nos dio el mejor esperada fenotipo RNAi. El método es fácil de realizar, reproducible, y se cuantifica fácilmente. Por otra parte, el protocolo minimiza el uso de equipo especializado, por lo que es adecuado para laboratorios pequeños o aquellos en instituciones predominantemente de licenciatura.
Protocol
1. Preparación de las placas de RNAi de alimentación que llevan la secuencia del gen diana
- Si se utilizan las bibliotecas RNAi disponibles comercialmente (por ejemplo, de LifeSciences Fuente BioScience), vaya al paso 1.4. Alternativamente, clonar secuencias de genes diana en el vector L4440, un gusano utiliza comúnmente RNAi plásmido 8, por el protocolo de clonación.
- Transformar el plásmido recombinante en la cepa bacteriana HT115 (DE3), cultivarlas en placas de agar LB con 25 mg / ml de carbenicilina y 12,5 mg / ml de tetraciclina, y recoger un solo clon para su uso futuro.
- Mientras tanto, transformar el vector vacío L4440 en la cepa bacteriana HT115 para utilizar como un control para los experimentos.
- Cultura tanto recombinantes como vacío L4440 portadoras de bacterias en 1 ml de caldo LB con 100 ug / ml de ampicilina durante la noche a 37 ° C. La tetraciclina no se añade debido al hecho de que disminuye la eficiencia de RNAi.
- Añadir otra caldo de 5 ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina durante la noche en el culre, incubar durante 4-6 horas otro a 37 ° C.
- Seed 0,5 ml recombinante o vacío L4440 transporte de cultivo bacteriano en las placas de gusanos RNAi. Marque todas las placas con el nombre de clon.
- Marcar las placas y se incuban durante la noche a 37 ° C para crecer césped bacteriano, que son las placas de RNAi con o sin la secuencia del gen objetivo. Al menos 2 placas deben estar preparados para cada condición.
2. Worms Cultura en las placas de alimentación RNAi
- Conviene esterilizar la punta de un pico de platino gusano de alambre. Utilice el gusano de selección para escoger 6-10 cuarta etapa larvaria (L4) hermafroditas a cada placa de ARNi que contiene ya sea recombinante o vacío L4440; los animales se utilizan las bacterias como fuente de alimento.
- Vamos hermafroditas crecer a 20 ° C (una condición de cultivo estándar para C. elegans) durante la noche, se convertirán en adultos jóvenes el día siguiente.
- Traslado 6-10 adultos jóvenes en un nuevo debidamente etiquetado y preparado placa RNAi.
- Deje que eladultos ponen huevos durante 4-6 horas, a continuación, retire todos los adultos de la placa; este paso es sincronizar la progenie. Una vez que las madres se retiran, empieza a contar el tiempo. Este es el tiempo cero.
- Las placas se incuban a 20 ° C para permitir que los animales crezcan a la etapa de desarrollo específico, en este protocolo, elegimos los adultos jóvenes para el análisis fenotípico. Para los derribos que se desarrollan a un ritmo normal, de 72 horas de incubación es suficiente para que los animales se convierten en adultos jóvenes. Sin embargo, varios genes afectan el desarrollo animal diferente. Si RNAi hace que los animales crezcan a un ritmo diferente, los adultos jóvenes pueden ser identificados como aquellos hr no más de 24 L4 pasado con el desarrollo completado vulvar y embriones de 2-6 en el útero (si es fértil). Para identificar otras etapas de desarrollo, el investigador debe utilizar el desarrollo gonadal y la vulva como guía.
3. Puntuación Fenotipos tamaño corporal de RNAi tratada Worms
- Colocar dos capas de cintas de etiquetas de colores sobre un portaobjetos de vidrio. Haz dos de lassE diapositivas de vidrio. A continuación, colocar un portaobjetos de vidrio nuevo entre los dos portaobjetos con cinta. Derretir 2% de agarosa en agua, aplicar una gota en el centro de la placa de vidrio nuevo, a continuación pulse el portaobjetos de vidrio segundos en la parte superior para formar una capa delgada de agarosa al 2% como se ha descrito anteriormente 9.
- Una vez que se ha solidificado de agarosa, retire la placa de vidrio superior, el portaobjetos con agarosa almohadilla está listo para cargar gusanos. Etiqueta de la diapositiva con el nombre de clon.
- Añadir 10 l 25 mM NaN 3 a la plataforma de agarosa; recoger animales 30-40 en el NaN 3 solución para inmovilizarlos, a continuación, poner el cubreobjetos en la parte superior, repetir, tanto recombinantes y vacío L4440 transporte de RNAi animales tratados.
- Imagen de los gusanos bajo microscopio de disección con lente objetivo 2.5x, aquí usamos Leica cámara digital con soporte Qcapture software.
- Para la calibración, primero capturar una imagen de una regla micrómetro estándar. A continuación, abra la imagen en Image-Pro software, haga clic en "medida" y seleccione "Calibración" y elija"Asistente de calibración espacial". Con "calibrar la imagen activa" seleccionado, haga clic en "Siguiente". Ingrese el nombre para la calibración y asegúrese de que las unidades de referencia espacial se ponen a micrómetro. A continuación, marque la casilla "crear una calibración de referencia" y haga clic en "Siguiente". Haga clic en "línea de referencia empate". Una barra de escala de referencia aparecerá. Cambiar la posición de la barra de escala para coincidir con los extremos del micrómetro, a continuación, indican que la referencia indica 1.000 unidades. Haga clic en "Aceptar", "Siguiente" y "Finalizar".
- Una vez que el software está calibrado, abrir una imagen de gusano. A continuación, seleccione en la "medida" del menú, seleccione "Calibración" y haga clic en "select espacial". En el menú desplegable, seleccione el nombre del archivo creado para la calibración de micrómetros. A continuación, en la "medida" del menú, seleccione "mediciones". En la ventana que se abre, seleccione la herramienta libre de dibujar y trazar una línea que pasa por el centro del cuerpo del animal, de la cabeza a la cola con el ratón del ordenador (Figura 1). La longitud se muestran en la ventana. Ahoradispone de dos grupos de datos: longitud corporal de los animales tratados con genes objetivo RNAi y control de los animales tratados con vacío L4440 vector.
- Exportar las mediciones de longitud en un archivo de Microsoft Excel, u otro software estadístico adecuado. Analizar los datos calculando la desviación media y estándar para cada muestra. Luego compare las muestras mediante la t de Student prueba.
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Representative Results
En nuestra investigación, nos centramos en el tamaño corporal regulación por la vía DBL-1/TGF-β. La pérdida de función de los resultados vía DBL-1 en el tamaño corporal pequeño, como una longitud de cuerpo más corto en comparación con el de tipo salvaje animales 7,10,11. Así, las pantallas de C. elegans mutantes tamaño del cuerpo son capaces de identificar TGF-β componentes de señalización y modificadores. DBL-1 de señalización está mediada por una conservadas TGF-β vía de transducción de señal que incluye los receptores de la superficie celular e intracelulares transductores de señal Smad 12. Para probar la eficacia de RNAi de alimentación para la identificación de mutantes del tamaño corporal, se utilizó esta técnica para derribar DBL-1 vía componentes: dbl-1/ligand, 2, 3 sma-sma-sma-4/Smads, y sma-6/receptor. Para nuestro estudio, hemos utilizado dos diferentes RNAi hipersensible C. elegans cepas para realizar el experimento: eri-1; lin-15b y 13,14 FRR-3. Mientras tanto, también se utiliza N2 (standard de tipo salvaje) y la cepa 36-lin, un componente de la vía lin-15 RNAi cuya sensibilidad es sin embargo similar a N2 13. Nuestros resultados (Figura 2) muestran que todas estas cepas muestran el fenotipo de cuerpo corto tamaño como se esperaba (p <0,001), excepto SMA-6 RNAi en lin-36 de fondo. En FRR-3 de fondo, longitud del cuerpo de los adultos jóvenes después de RNAi tratamiento fueron del 84 ~ 95% de vector solo. En eri-1; lin-15b fondo, longitud del cuerpo de los adultos jóvenes después de RNAi fue del 68 ~ 86% de los animales de control. En comparación con las cepas de lin-36 y N2, tanto del RNAi hipersensible FRR cepas-3 y eri 1-lin-15b, eran más sensibles.
Figura 1. Imágenes representativas de longitud corporal del animal que se está midiendo imagen A. animal antes de la medición.;
Figura 2. Longitud del cuerpo de animales en los que los componentes DBL-1 vía han sido inactivados por método de alimentación RNAi. Animales RNAi en todas estas cepas fondo que se muestra el fenotipo de la longitud del cuerpo más corto esperado (p <0,001), excepto SMA-6 RNAi en lin-36 fondo. RNAi de la FRR-3 y 1-eri; lin-15b cepas demostraron un fenotipo más fuerte que el de lin-36 y fondos de N2.
Figura 3. Esquema descripción de la utilización de la estrategia de alimentación de RNAi para la detección de genes candidatos.
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Discussion
En este protocolo, describimos nuestro método para la identificación de mutantes defectuosos tamaño corporal de C. elegans por alimentación RNAi. Este método es aplicable a la identificación de los componentes de señalización de TGF-β. Puesto que tales componentes están altamente conservadas a través de la evolución 15, tales pantallas son relevantes para elucidar los mecanismos moleculares de la señalización de TGF-β en todos los metazoos. Una consideración importante en el diseño de dicha pantalla es la cepa de partida. Hemos demostrado que tanto eri-1; lin-15b y FRR-3 son más sensibles a la alimentación de RNAi que las cepas de control, lo que es consistente con estudios previos 12,13. Sin embargo, a pesar de que eri-l; lin-15b demostrado el fuerte fenotipo, los animales no crecen bien y produjo progenie pocos. Así, en una pantalla de gran escala, que no habría suficientes animales para anotar fenotipos de esta cepa. Como resultado, se favorece la FRR-3 cepa de aplicar laRNAi técnica de alimentación a la regulación del tamaño corporal. Una segunda opción a considerar en la cepa de partida es la posibilidad de iniciar una pantalla con la vía de DBL-1 intacta o para comenzar con una cepa sensible en la que es o bien la vía de DBL-1 comprometida o hiperactiva. Estos puntos de partida alternativos pueden conducir a la identificación de solapamiento pero diferentes conjuntos de componentes de señalización. El protocolo también puede ser modificada para el estudio de otros fenotipos postembryonic. En este caso, la etapa de los animales que se obtuvo para el fenotipo de interés puede necesitar ser modificada mediante la alteración de la duración del crecimiento en el paso 2.5. Antes de iniciar una pantalla de gran escala para otros fenotipos, podríamos recomendar una pantalla piloto con genes conocidos para producir el fenotipo de interés, como se describe aquí para doble-1, SMA-2, sma sma-3-4, y-SMA 6.
Mediante el uso de este protocolo, derribando DBL-1 vía componentes mostraron fenotipo esperado longitud del cuerpo. Tmanguera animales ARNi eran aproximadamente 68-95% en la longitud en comparación con los animales de control. En estudios anteriores, DBL-1 vía de pérdida de función de mutantes genéticos en la edad adulta son aproximadamente un 50% más corta que de tipo salvaje animales 7,10,11. Por lo tanto, la técnica de alimentación RNAi que aquí se presenta no eliminar por completo la actividad del gen. Por lo tanto, el método puede estar limitado en su capacidad de identificar componentes de la ruta que tienen un fenotipo débil. Mientras tanto, dado que hay muchos genes que regulan la longitud del cuerpo, los genes identificados a partir de la pantalla también podría no necesariamente caer en DBL-1 vía. Otros experimentos deben llevarse a cabo para colocar a los candidatos en las vías, como sucede con cualquier método de otra pantalla.
En resumen, las pantallas de RNAi de alimentación en C. elegans han demostrado ser útiles en la identificación de genes implicados en un proceso de interés. En este protocolo, se han optimizado los protocolos existentes para ser altamente eficaz en la identificación de defectos de tamaño del cuerpo. El protocolo optimizado puede ser másmodificada para el estudio de otros fenotipos postembryonic.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a James Clark para proporcionar figuras de animales en diferentes puntos en el tiempo de desarrollo. C. elegans cepas en este estudio se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis, que es apoyado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Este trabajo fue apoyado por CIRG 1817 de CUNY a JL y CSD, y por el NIH 1R15GM073678-01 y 1R15GM097692-01 a la CDS Agradecemos al Dr. William J Rice, el Dr. Nathalia Holtzman, y Silvestrini Melissa para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo se llevó a cabo en cumplimiento parcial de los requisitos para un doctorado en el Centro de Graduados de la City University de Nueva York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
