En kvantitativ fremgangsmåte for analyse av kromosomreplikasjon timingen er beskrevet. Metoden utnytter BrdU inkorporering i kombinasjon med fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) for å vurdere replikering timing av pattedyr kromosomer. Denne teknikken gjør det mulig for direkte sammenligning av omorganiseres og un-rearrangerte kromosomer innenfor den samme cellen.
Pattedyrs DNA replikasjon initierer på flere steder langs kromosomene til forskjellige tider i løpet av S-fasen, etter en temporal replikering program. Spesifisering av replikering timing er tenkt å være en dynamisk prosess regulert av vevsspesifikke og utviklingsmessige signaler som er mottakelig for epigenetic endringer. Men fortsatt mekanismene som regulerer hvor og når DNA replikasjon initierer langs kromosomene dårlig forstått. Homologe kromosomer vanligvis replikere synkront, men det er bemerkelsesverdig unntak til denne regelen. For eksempel, i kvinnelige pattedyrceller en av de to X-kromosomer blir sent replikerende gjennom en prosess kjent som X inaktivering 1. Sammen med denne forsinkelsen i replikering timing, anslått til å være 2-3 timer, blir de fleste av gener transkripsjonelt taushet på ett X-kromosom. I tillegg regulerer en diskret cis virkende locus, kjent som X-inaktivering sentrum denne X inaktivering prosessen, inkludert the induksjon av forsinket replikering timing på hele inaktive X-kromosom. I tillegg er visse kromosom rearrangementer funnet i kreftceller og i celler eksponert for ioniserende stråling vise en betydelig forsinkelse i replikasjon timing av> 3 timer som påvirker hele kromosom 2,3. Nyere arbeid fra vårt laboratorium tyder på at forstyrrelser av diskrete cis-fungerende autosomal loci resulterer i en ekstremt sent replikere fenotype som påvirker hele kromosom 4. Ekstra "kromosom tekniske 'studier tyder på at visse kromosom rearrangements påvirker mange forskjellige kromosomer resultat i denne unormale replikering-timing fenotype, noe som tyder på at alle pattedyr kromosomer inneholder diskrete cis-virkende loci som styrer riktig replikering timing av enkelte kromosomer 5.
Her presenterer vi en fremgangsmåte for kvantitativ analyse av kromosomreplikasjon timing kombinert med fluorescerende in situ hybridisering. Dettefremgangsmåte tillater en direkte sammenligning av replikering timing mellom homologe kromosomer innenfor samme celle, og ble tilpasset fra 6. I tillegg gir denne metoden for entydig identifikasjon av kromosomale rearrangements som korrelerer med endringer i replikering timing som påvirker hele kromosom. Denne metoden har fordeler fremfor nylig utviklet høy gjennomstrømming microarray eller sekvensering protokoller som ikke kan skille mellom homologe alleler stede på omorganiseres og un-omorganisert kromosomer. I tillegg, fordi metoden beskrevet her evaluerer enkeltceller, kan det oppdage endringer i kromosomreplikasjon timing på kromosomale rearrangements som er tilstede i bare en brøkdel av de celler i en populasjon.
Utarbeidelse av kromosom sprer er et kritisk punkt for vellykket replikering-timing analysen beskrevet her. Inkludering av en colcemid forbehandling trinn før hypoton behandling kan hjelpe til frekvens og spredning av mitotiske celler. Vi vanligvis eksponere cellene til colcemdi for 1-3 hr før høsting, og bruke colcemid ved en endelig konsentrasjon på 10 ug / ml. Imidlertid kan det inntas et colcemid forbehandling trinn endre varigheten G2 og dermed kan endre den tilsynelatende replikering timing og tilstand av kond…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute, CA131967.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |