Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kromosom Replikere Timing Kombinert med fluoriserende Published: December 10, 2012 doi: 10.3791/4400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Summary

En kvantitativ fremgangsmåte for analyse av kromosomreplikasjon timingen er beskrevet. Metoden utnytter BrdU inkorporering i kombinasjon med fluorescerende

Abstract

Pattedyrs DNA replikasjon initierer på flere steder langs kromosomene til forskjellige tider i løpet av S-fasen, etter en temporal replikering program. Spesifisering av replikering timing er tenkt å være en dynamisk prosess regulert av vevsspesifikke og utviklingsmessige signaler som er mottakelig for epigenetic endringer. Men fortsatt mekanismene som regulerer hvor og når DNA replikasjon initierer langs kromosomene dårlig forstått. Homologe kromosomer vanligvis replikere synkront, men det er bemerkelsesverdig unntak til denne regelen. For eksempel, i kvinnelige pattedyrceller en av de to X-kromosomer blir sent replikerende gjennom en prosess kjent som X inaktivering 1. Sammen med denne forsinkelsen i replikering timing, anslått til å være 2-3 timer, blir de fleste av gener transkripsjonelt taushet på ett X-kromosom. I tillegg regulerer en diskret cis virkende locus, kjent som X-inaktivering sentrum denne X inaktivering prosessen, inkludert the induksjon av forsinket replikering timing på hele inaktive X-kromosom. I tillegg er visse kromosom rearrangementer funnet i kreftceller og i celler eksponert for ioniserende stråling vise en betydelig forsinkelse i replikasjon timing av> 3 timer som påvirker hele kromosom 2,3. Nyere arbeid fra vårt laboratorium tyder på at forstyrrelser av diskrete cis-fungerende autosomal loci resulterer i en ekstremt sent replikere fenotype som påvirker hele kromosom 4. Ekstra "kromosom tekniske 'studier tyder på at visse kromosom rearrangements påvirker mange forskjellige kromosomer resultat i denne unormale replikering-timing fenotype, noe som tyder på at alle pattedyr kromosomer inneholder diskrete cis-virkende loci som styrer riktig replikering timing av enkelte kromosomer 5.

Her presenterer vi en fremgangsmåte for kvantitativ analyse av kromosomreplikasjon timing kombinert med fluorescerende in situ hybridisering. Dettefremgangsmåte tillater en direkte sammenligning av replikering timing mellom homologe kromosomer innenfor samme celle, og ble tilpasset fra 6. I tillegg gir denne metoden for entydig identifikasjon av kromosomale rearrangements som korrelerer med endringer i replikering timing som påvirker hele kromosom. Denne metoden har fordeler fremfor nylig utviklet høy gjennomstrømming microarray eller sekvensering protokoller som ikke kan skille mellom homologe alleler stede på omorganiseres og un-omorganisert kromosomer. I tillegg, fordi metoden beskrevet her evaluerer enkeltceller, kan det oppdage endringer i kromosomreplikasjon timing på kromosomale rearrangements som er tilstede i bare en brøkdel av de celler i en populasjon.

Protocol

1. BrdU Incorporation (Terminal Merking)

  1. Plate celler til omtrent 70% konfluens i en 150 mm vevskultur parabolen 24 hr før tilsetningen av BrdU.
  2. Erstatt medier med fersk komplette medier inneholdende 20 pg / ml BrdU (Sigma) på hensiktsmessige tidspunkter før høsting. Lengden av tid dyrkes cellene i medier med BrdU vil variere med celletype og arter, vanligvis G2 fasen varer mellom 2 og 5 timer (figur 1).

2. Kromosom Harvest of Monolayer Cells kulturer

  1. Fjern dyrkingsmedier fra platen og samle 10 ml i et 15 ml konisk sentrifugerør. Kast gjenværende media.
  2. Skyll celler en gang med 10 ml Versine [eller HBSS (Sigma)].
  3. Tilsett 5 ml 0,25% trypsin i Versine (eller HBSS) til plate. Inkuber ved romtemperatur inntil celler løsrevet fra platen.
  4. Legg trypsinert cellesuspensjon til røret som inneholder 10 ml av media fra trinn 2.1. </ Li>
  5. Sentrifuger ved 400 xg i 10 minutter for å pelletere cellene. Aspirer supernatant forlater 0,5 ml av media pluss cellepellet.
  6. Resuspender celler grundig ved pipettering med en Pasteur pipette.
  7. Tilsett 3 dråper hypoton løsning (0,075 M KCl (Sigma) oppvarmet til 37 ° C), bland cellesuspensjonen med en Pasteur pipette. Tilsett 0,5 ml hypoton løsning og bland igjen med en Pasteur pipette. Bringe volumet av hypoton løsning til 5 ml og bland igjen. Inkuber ved 37 ° C i 20-45 min, avhengig av celletype.
  8. Sentrifuger ved 400 xg i 10 min. Aspirer supernatant forlater 0,5 ml av media pluss cellepellet.
  9. Resuspender cellepelleten ved å forsiktig flicking røret. De osmotisk hovne cellene vil være skjør på dette punktet, slik at forsiktighet bør utvises for ikke å forstyrre de cytoplasmatiske membraner.
  10. Tilsett 3 dråper Carnoy er fiksativ (1:3 iseddik: Methanol), bland forsiktig pipettere med en Pasteur pipette. Tilsett 0,5 ml fiksativ og bland forsiktig pipettere med en Pasteur pipette. Bringe volumet av fikseringsmiddel for å 5 ml og bland igjen ved forsiktig pipettere med en Pasteur pipette. Faste celler kan lagres i mørket ved -20 ° C i flere måneder.
  11. Sentrifuger og aspirere som i trinn 2.8.
  12. Resuspender cellepelleten i fersk fiksativ; estimere volumet av pelleten og add ~ 10x volumet av Carnoy sin fikseringsvæske.
  13. Legg cellesuspensjonen dråpevis på våte, iskald mikroskopobjektglass, hold lysbildet på en ~ 45 ° vinkel og tillate cellesuspensjonen å strømme over overflaten av lysbildet. Legge lysbilde flatt på papirhåndklær og flom lysbildet med fiksativ og la det lufttørke. Kontroller lysbilder for tilstedeværelsen av mitotiske sprer hjelp en invertert mikroskop.

3. RNase Behandling og etanol dehydrering

  1. Plass 200 ul 10 ug / ml RNase A (Sigma) i 2x SSC til hvert lysbilde; inkuber ved 37 & deg, C i 1 time.
  2. Wash glir 3 ganger med 2x SSC, pH 7,0 ved romtemperatur i 3 min hver.
  3. Dehydrere lysbilder gjennom en EtOH (Sigma)-serien (70%, 90% og 100%) ved romtemperatur i 3 min hver.
  4. Lufttørke lysbildene ved romtemperatur.

4. Utarbeidelse av Probe Cocktails for BAC Plus Kromosom-spesifikk centromere Enumeration Probe (CEP) eller for helt kromosom Paints in situ hybridisering

  1. For BAC / CEP samtidig hybridisering, forberede to separate probe cocktails for pre-hybridisering. Vi har funnet ut at pre-hybridisering BAC og CEP sonder separat under ulike stringencies resulterer i mindre bakgrunn og større signal intensiteter. Vi har også funnet at enkelte Fosmids kan også bli brukt i stedet av BAC kloner. Cocktail formulering beskrevet nedenfor representerer volumene for et enkelt lysbilde. Hvis prosessere flere lysbilder ved hjelp av de samme sonder bare øke volumene appropr iately.

    * BAC DNA probe cocktail:

    11,5 pl hybridiseringsbuffer (50% formamid (Sigma) / 2x SSC / dekstransulfat (Sigma)) 2 pl dH 2 O

    2,5 pl BAC/Cot1 DNA i dH 2 O (se nedenfor for merking protokollen) 15 pl totalt volum

    * CEP probe cocktail:

    7 pl CEP hybridiseringsbuffer (65% Formamide/2x SSC / dekstransulfat) 2 ul dH 2 O

    1 pl CEP/Cot1 DNA (kjøpt prelabeled med Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 pl totalt volum

    * Etter denaturering og pre-hybridisering (trinn 5.1) mix BAC probe med CEP probe på et 3:2 ratio 25 pl / slide og bland probe cocktails.

    ELLER

  2. Delmengde 20 pl / lysbilde av helt kromosom Paint probe (Cy3/Texas Red) inn i røret. Fortsett til denaturering og pre-hybridisering trinn.
"> 5. Skyv og Probe denaturering og in situ hybridisering

  1. Denaturerer probe cocktail (s) ved 75 ° C i 10 min. Pre-hybridisere ved 37 ° C i 30 min for å tillate Cot1 DNA til hybridisere til repetitive sekvenser og for å forhindre påfølgende hybridisering Metafasekromosomer.
  2. Denaturere lysbilder i Coplin krukker i 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 ved 72 ° C i 3 min.
  3. Umiddelbart dehydrerer lysbilder gjennom en EtOH serie (70%, 90% og 100%) i Coplin krukker ved 4 ° C i 3 min hver.
  4. Tillat lysbildene lufttørke i romtemperatur.
  5. Forvarme lysbilder til 45 ° C på lysbildet varmere for siste 10 min av sonden før hybridzation (trinn 5.1). Bland pre-hybridisert probe cocktails ved behov og legge 25 ul til hvert lysbilde, forsiktig plasserer et dekkglass på hvert lysbilde og sel langs alle kantene med gummi sement. Inkuber over natten ved 37 ° C i en fuktet kammer for å forhindre fordamping.

  1. Vask lysbilder i Coplin krukker 3 ganger i 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 ved 38 til 40 ° C i 3 min hver. Temperaturen på vasker kan variere mellom prober. Hvis det er høy bakgrunn hybridisering kan øke temperaturen på vasker. Derimot, hvis signalet er svak, og det er ingen bakgrunn så kan senke temperaturen av disse vaskinger.
  2. Wash glir 1 gang i PN-buffer ved romtemperatur i 3 min, og gå videre til BrdU deteksjon trinn.

7. BrdU Detection

  1. Blokkere lysbilder med PNM buffer i 10 min (200 pl / skyv) ved romtemperatur i mørket.
  2. Renne lysbilder ved å slå på kanten på et papirhåndkle. Legg 100 pl anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche eller Millipore) i PNM buffer i 30 minutter ved 37 ° C.
  3. Vask lysbilder 3 ganger i PN-buffer ved romtemperatur i 3 min hver.
  4. Renneoverflødig PN buffer på glir en av gangen ved å slå på kanten på et papirhåndkle. Tilsett 20 ul DAPI / antifade montering løsning (Invitrogen). Dekk lysbilde med et papirhåndkle og trykk ned på dekkglasset å tvinge ut luftbobler og overflødig monteringsløsning. Fortsett til bildeanalyse.

8. Ta bilder og kvantifisere BrdU innlemmelse

  1. Bildene er tatt med et Olympus BX61 fluoriserende mikroskop og Olympus CCD kamera, 100x objektiv, automatisk filter-hjulet og Cytovision programvare (Applied Imaging). BrdU fanges ved hjelp av en FITC filter; kromosom maling (Texas Red, Metasystems eller Cytocell), er BAC-tallet (Cy3) og CEP (Vysis Spectrum Orange) prober tatt med en Texas Rød eller Cy3 filter, DAPI er tatt med et DAPI Filter (se figur 2 og 3).
  2. Individuelle kromosomer av interesse er identifisert med BAC / CEP eller kromosom-spesifikke maling prober (Tall 2B og 3B). Utnytteden Cytovision programvare, hver kromosom av interesse er "cut-out" fra metafase spredning som helhet, er en linje trukket gjennom de langs lengden av kromosomet fra kort arm til lange arm (Tall 2C og 3C). Den Cytovision programvaren brukes for å kvantifisere pikselintensiteten profil langs lengden av hvert kromosom. Den Cytovision programvare beregner areal som opptas av piksler og kvantifiserer intensiteten av piksler representert ved BrdU eller DAPI signaler på hver isolert kromosom. Gjennomsnittlig pikselintensiteten representert av hvert kromosom multipliseres deretter med det areal som opptas av disse piksler for å oppnå det totale antall piksler (tabell 1 og figur 4). I tillegg gir denne protokollen for visualisering av de nyeste replikere regioner av kromosomer. Følgelig, tillater banded mønster av BrdU inkorporering for påvisning av aktivt replikerende regioner av kromosomer, og forskjeller i replikering timing mellom Chromosome parene blir sett som forskjeller i dette banding mønsteret (Figurene 2 og 3). Endelig kan disse forskjellene i bindende mønstre bli sammenlignet med kjente replikering timing kart for hvert kromosom 6,7, som åpner for et estimat av replikering tidsforskjellen mellom homologe kromosomer eller kromosom armene 4. For eksempel, er de to kromosom 6 i fig 3A viser en forskjell i banding mønster av> 2 hr når sammenlignet med normal replikering timingen av kromosom 6 4.
    I tillegg er en lignende fremgangsmåte til den som er beskrevet her har blitt brukt med hell for studiet av den asynkrone replikering timingen mellom inaktive og aktive X kromosomer 8,9. De aktive og inaktive X-kromosomer ble identifisert ved hjelp av X-kromosom maling. Bilder ble kjøpt ved hjelp av Quips mFISH programvare (Vysis) og antall piksler okkupert av X-kromosomer og antall piksler som benyttes av fluorescently laBeled BrdU ble da beregnet ved hjelp av NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Oversettelse av BAC DNA for Fluorescent Merking (Vysis)

  1. Legg til følgende probe mix å kjølt en mikrosentrifuge tube:
    70 pl (4 mikrogram DNA) i dH 2 O
    10 ul 0,2 mM dUTP-oransje eller grønn
    20 ul 0,1 mM dTTP
    20 ul 10x Nick Oversettelse Buffer
    40 pl NT dNTP tallet (minus dTTP)
    40 pl nick Oversettelse enzym
    200 pl totalt volum
    Inkuber @ 16 ° CO / N. Stopp reaksjonen ved oppvarming ved 70 ° C i 10 min. Chill på isen for 5 min.
  2. Utfelle DNA med etanol ved å legge følgende til sonden mix:
    200 pl probe løsning
    48 ul 3 M NaOAc
    160 ul Cot1DNA (0,25 mikrogram / ul)
    1200 ul 100% EtOH
  3. Oppbevar ved -80 ° C i 10 min i O / N.
  4. Snurr jegn kaldt på 12000 xg i 20 min. Dekanter av EtOH. Vask en gang med 70% EtOH. Spinn som før. Dekanter av EtOH. Lufttørke bare til EtOH fordamper. Resuspender i 40 pl dH 2 O for endelig konsentrasjon på 100 ng / ul BAC DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på replikering analyse timing for menneskets kromosom 6 er vist i figur 2. Celler som inneholder en sletting av ASAR6 genet 4, som ligger på 6q16.1, ble utsatt for BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandles for fisk med et kromosom 6 maling probe (Vysis) og for BrdU inkorporering. Merk at det er en betydelig forskjell i BrdU banding mønster mellom de to 6-ere, som er forenlig med en forsinkelse i replikasjon timing av> 2 t for en av kromosom 6 står [se 4 for replikering timingen banding mønster av kromosom 6 før slettingen]. I tillegg er det en betydelig forskjell i den totale mengden av BrdU inkorporering (piksler) når sammenlignet med en tilsvarende analyse av DAPI farging (figur 2D).

Et annet eksempel på replikering analyse timing for menneskets kromosom 6 er vist i figur 3.. Celler som inneholder den same sletting av ASAR6 genet 4 vises hvis Figur 2 ble utsatt for BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandles for fisk med et kromosom 6 CEP probe pluss en BAC inneholder ASAR6 genet og for BrdU inkorporering. Legg merke til at den slettede kromosom 6 (Δ6) viser mer BrdU innlemmelse og en mer utvidet banding mønster av BrdU innlemmelse enn de ikke-slettet kromosom 6. Mitotiske sprer fra 7 forskjellige celler ble behandlet som i figur 3 og de ​​pixel profiler for både DAPI og BrdU er vist i Tabell 1.

Figur 1
Figur 1. BrdU terminal merket ordningen. En typisk S-fasen i pattedyrceller sist for 8-10 hr, og G2 er typisk 2-5 timer. BrdU tilsettes for økende perioder (grønne piler) for å merke de siste partier av kromosomene å replikere. The kromosomer i pattedyrceller replikere ifølge en tidsmessig program, med tidlig og sent replikering forekommende på begynnelsen og slutten av S-fasen henholdsvis (sort linje). Inaktive X-kromosomer er forsinket i replikering timing med flertallet av DNA-syntese oppstår under andre halvdel av S-fasen (blå linje). Kromosomer med forsinket replikering timing er forsinket i både initiering og gjennomføring av DNA-syntese, med aktiv replikering fortsetter gjennom G2 (rød linje). Asynkrone kulturer høstes for mitotiske celler og behandlet for BrdU innlemmelse og fisk.

Figur 2
Figur 2. Asynkron replikering av menneskelig kromosom 6. Celler som inneholder en konstruert sletting av ASAR6 genet 4 ble behandlet med BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandlet for BrdU innlemmelse og fiske med krom osome 6 maling som probe. DNA ble farget med DAPI (blå). A) En mitotiske spredning inneholder en typisk "banded" mønster av BrdU innlemmelse (grønn) vises. Kromosomet 6 maling probe hybridisert til to kromosom 6-tallet (rød) i denne cellen. B) De to kromosom 6 tallet (I og II) ble "klippet" og vist med de tre fluorescerende etiketter atskilt inn i forskjellige bilder. C) kromosom 6-tallet ble analysert ved hjelp av Cytovision programvare og signalstyrken profiler for både DAPI (blå) og BrdU (grønn) vises. Den røde linjen viser den veien brukes, fra kort arm (p) til lange arm (q) for kvantifisering av både BrdU og DAPI. Distance refererer til lengden av hvert kromosom fra korte arm (p) til lange arm (q) i piksler. D) Kvantifisering av det totale signalet både DAPI og BrdU fluorescens. De totale verdier representerer den gjennomsnittlige pikselintensiteten multiplisert med området representert ved disse piksler.

igur 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
Figur 3. Forsinket replikering av menneskelig kromosom 6 inneholder en sletting av ASAR6. Celler som inneholder en konstruert sletting av ASAR6 genet 4 ble behandlet med BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandlet for BrdU innlemmelse og fiske med kromosom 6 CEP pluss en BAC inneholder ASAR6 genet som prober. DNA ble farget med DAPI (blå). A) En mitotiske spredning inneholder en typisk "banded" mønster av BrdU innlemmelse (grønn) vises. Kromosom 6 CEP probe hybridisert til to kromosom 6 tallet (stor rød centromeric signal), og BAC hybridisert til en enkelt kromosom 6 (liten rød signal på den lange arm) i denne cellen. Obs forskjellen i BrdU banding mønster mellom de to 6-ere. B) Det slettede kromosom 6 er representert ved Δ6 og den ikke-slettet 6 med 6. De to 6-ere var "klippe ut" og vises med de tre fluorescerende etiketter delt inn i forskjellige bilder. C) Than kromosom 6-tallet ble analysert ved hjelp av Cytovision programvare og signalstyrken profiler for både DAPI (blå) og BrdU (grønn) vises. Den røde linjen viser den veien brukes, fra kort arm (p) til lange arm (q) for kvantifisering av både BrdU og DAPI. Distance refererer til lengden av hvert kromosom fra korte arm (p) til lange arm (q) i piksler. D) Kvantifisering av det totale signalet både DAPI og BrdU fluorescens. De totale verdier representerer den gjennomsnittlige pikselintensiteten multiplisert med området representert ved disse piksler.

Figur 4
Figur 4. Kvantifisering av replikering tidsforskjellen mellom kromosom 6 tallet. Celler som inneholder en konstruert sletting av ASAR6 genet 4 ble behandlet med BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandlet for BrdU innlemmelse og fiske med kromosom 6 CEP probe pluss enBAC inneholder ASAR6 genet som probe. Mitotiske oppslag var behandlet som i figur 3 og verdiene for 7 forskjellige celler er vist (se tabell 1). A) DAPI farging ble kvantifisert og det totale antall piksler vises for hver celle. Merk at det er bare ~ 10-20% forskjell mellom kromosomer innenfor den samme cellen. B) BrdU innlemmelse ble kvantifisert fra de samme kromosomer som panel B ovenfor. Merk at det er> 2 ganger forskjell mellom de totale pikselverdiene for slettet og ikke-slettet kromosom 6 tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utarbeidelse av kromosom sprer er et kritisk punkt for vellykket replikering-timing analysen beskrevet her. Inkludering av en colcemid forbehandling trinn før hypoton behandling kan hjelpe til frekvens og spredning av mitotiske celler. Vi vanligvis eksponere cellene til colcemdi for 1-3 hr før høsting, og bruke colcemid ved en endelig konsentrasjon på 10 ug / ml. Imidlertid kan det inntas et colcemid forbehandling trinn endre varigheten G2 og dermed kan endre den tilsynelatende replikering timing og tilstand av kondensasjon av kromosomene 3.

Denne prosedyren kan anvendes på mange forskjellige celletyper og arter ved å variere lengden av BrdU inkubering, noe som avhenger cellesyklus varighet. For de fleste humane og mus cellelinjer, er G2 fase typisk 3-6 hr; derfor BrdU behandlinger er typisk i denne serien. Et alternativ til BrdU er 5-etynyl-2'deoxyuridine (Edu) og den påfølgende deteksjon ved hjelpen fluoriserende azide og "klikk kjemi" reaksjon 10. Den Edu deteksjon ordningen har flere fordeler over BrdU deteksjon ordningen. For eksempel ikke påvisning av EDU ikke kreve prøve fiksering eller DNA denaturering. Således kan bruk av EDU å asses replikering timing kombineres med enkle G-banding teknikker i stedet for fisk å identifisere kromosomene av interesse.

Replikering timing protokollen beskrevet her er spesielt designet for å analysen sent S fase pluss eventuelle DNA-syntese som strekker seg inn G2. I tillegg kan DNA-replikasjon overvåkes hele S-fasen ved hjelp av denne fremgangsmåte ved hjelp av korte (15-30 min) pulser av BrdU etterfulgt av relativt lange jage perioder på 6-10 timer. Dette gir mulighet for visualisering av BrdU innlemmelse i både tidlig og midtre S-fase. For eksempel er visse tumor avledet kromosom rearrangementer forsinket både initiering og fullføring av DNA-syntese langs hele lengden av kromosomene 3

En fordel med denne replikering timing prosedyren er at det analyser replikering timing i enkeltceller. Derfor har det evnen til å oppdage forskjeller i replikering timing mellom homologe kromosomer som finnes i samme celle. Mens det finnes andre fremgangsmåter, f.eks. replikasjon timing i situ hybridisering (ReTiSH, 11), som har evnen til å oppdage forskjeller i replikering timing mellom alleler i bestemte loci på homologe kromosomer, kan fremgangsmåten beskrevet her oppdage forskjeller i replikering timingen langs hele lengden av kromosomer. I tillegg har denne prosedyren kan analysen forskjeller i replikering timingen av kromosomer som er tilstede i bare en brøkdel av celler av en populasjon 3. For eksempel mange kreftcellelinjer og primær tumor prøvene inneholder kromosom rearrangementer som er tilstede i mindre enn 50% av cellene. Vi er for tiden du bruker denne prosedyren til analysen kromosomeri grunnskole tumorprøver, har og vært i stand til å oppdage asynkron replikering mellom kromosomer i flere prøver. Men gitt at primære tumorprøver har et begrenset antall mitotiske tall, om lag en tredjedel av de primære kulturer klarte å gi tilstrekkelig antall mitotiske sprer seg.

En annen fordel som denne prosedyren har over microarray eller sekvensering baserte analyser er at enkelte kromosomer er analysert i stedet immunoutfelt DNA fra bassenger av celler. I immunoutfelling-baserte analyser polymorfismer må identifiseres og knyttes til konkrete alleler for å skille replikering timing mellom alleler.

Videre med erkjennelsen av at mange kreftceller inneholder mange kromosom rearrangements 12, og den observasjon at DNA replikasjon stress er forbundet med genomisk ustabilitet i kreftceller 13, mener vi at denne protokollen er et nyttig og enkelt verktøy feller rutineanalyse av replikering tidsberegningen av kromosomer i kreftceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute, CA131967.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Digital Camera Olympus UCMAD3

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Tags

Genetikk biokjemi molekylærbiologi cellebiologi Kromosomreplikasjon timing fluorescerende FISK BrdU cytogenetikk kromosom rearrangements fluorescensmikroskopi
Kromosom Replikere Timing Kombinert med fluoriserende<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, L., Thayer, M. Chromosome… More

Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter