Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em> In situ</em> La hibridación
Summary
Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con fluorescente<em> In situ</em> Hibridación (FISH) para evaluar el tiempo de replicación de los cromosomas de mamíferos. Esta técnica permite la comparación directa de los cromosomas reordenados y reordenados ONU-dentro de la misma célula.
Abstract
La replicación del ADN de mamíferos se inicia en varios sitios a lo largo de los cromosomas en diferentes momentos durante la fase S, siguiendo un programa de repetición temporal. La especificación de la sincronización de replicación se cree que es un proceso dinámico regulada por señales específicas de tejido y de desarrollo que son sensibles a las modificaciones epigenéticas. Sin embargo, los mecanismos que regulan dónde y cuándo se inicia la replicación del ADN a lo largo de los cromosomas sigue siendo poco conocida. Los cromosomas homólogos suele replicar de forma sincrónica, sin embargo, hay excepciones notables a esta regla. Por ejemplo, en células de mamífero hembra uno de los dos cromosomas X se convierte tarde replicación a través de un proceso conocido como inactivación X 1. Junto con este retraso en el tiempo de replicación, estimado en 2-3 horas, la mayoría de los genes se transcriptionally silenciados en un cromosoma X. Además, un discreto de acción en cis locus, conocido como el centro de la inactivación X, regula este proceso de inactivación X, incluyendo the inducción de la replicación de temporización retardada en el cromosoma X inactivo completo. Además, ciertos reordenamientos cromosómicos que se encuentran en las células cancerosas y en células expuestas a la radiación ionizante mostrar un retraso significativo en el tiempo de replicación de> 3 horas que afecta a todo el cromosoma 2,3. Trabajos recientes de nuestro laboratorio indican que la interrupción de discreta actuación cis resultado autosómica loci en un fenotipo de replicación muy tarde que afecta al 4 cromosoma entero. Estudios adicionales de ingeniería de cromosoma 'indican que los reordenamientos cromosómicos que afectan a los cromosomas diferente resultado, muchos en este momento la replicación anormal fenotipo, lo que sugiere que todos los cromosomas de mamíferos contienen discretas que actúan en cis loci que controlan la sincronización correcta replicación de los cromosomas 5.
Aquí, se presenta un método para el análisis cuantitativo de la replicación del cromosoma de temporización en combinación con hibridación in situ fluorescente. Estamétodo permite una comparación directa de la replicación de temporización entre cromosomas homólogos en la misma célula, y se adaptó a partir de 6. Además, este método permite la identificación inequívoca de los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con cambios en el plazo que afectan a la replicación de todo el cromosoma. Este método tiene ventajas sobre el reciente desarrollo de alto rendimiento micro-array o secuenciación protocolos que no pueden distinguir entre homólogos alelos presentes en reordenar y reorganizar un-cromosomas. Además, debido a que el método descrito aquí evalúa las células individuales, se puede detectar cambios en el tiempo de replicación en el cromosoma reordenamientos cromosómicos que están presentes en sólo una fracción de las células en una población.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación de extensiones de cromosomas es un paso crítico para el éxito de la replicación de temporización ensayo descrito aquí. La inclusión de una etapa de pretratamiento antes de la colcemid tratamiento hipotónico puede ayudar en la frecuencia y la propagación de las células mitóticas. Nos típicamente exponer las células a colcemdi de 1-3 h antes de la cosecha, y el uso colcemid a una concentración final de 10 ug / ml. Sin embargo, la inclusión de una etapa de pretratamiento colcemid puede alterar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer, CA131967.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
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IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
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