يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع الفلورسنت<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) لتقييم توقيت تكرار الكروموسومات الثدييات. هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة من الكروموسومات إعادة ترتيب وإعادة ترتيب للامم المتحدة داخل الخلية نفسها.
الثدييات تكرار الحمض النووي يبدأ في مواقع متعددة على طول الكروموسومات في أوقات مختلفة خلال المرحلة S، وبعد تكرار برنامج الزمني. ويعتقد مواصفات توقيت النسخ المتماثل لتكون عملية ديناميكية ينظمها العظة الأنسجة الخاصة والتنموية التي تستجيب لتعديلات جينية. ومع ذلك، فإن آليات تنظيم أين ومتى يبدأ على طول تكرار الحمض النووي الكروموسومات لا تزال غير مفهومة تماما. مثلي الكروموسومات تكرار عادة بشكل متزامن، ولكن هناك استثناءات لهذه القاعدة البارزة. على سبيل المثال، في خلايا الثدييات أنثى واحدة من اثنين من الكروموزومات العاشر يصبح تكرار أواخر خلال عملية تعرف باسم تعطيل X 1. جنبا إلى جنب مع هذا التأخير في توقيت النسخ المتماثل، تشير التقديرات إلى أن 2-3 ساعة، تصبح إسكات transcriptionally غالبية الجينات على الكروموسوم X واحد. بالإضافة إلى ذلك، منفصلة رابطة الدول المستقلة موضع المفعول، والمعروفة باسم مركز تعطيل X، ينظم هذه العملية تعطيل X، بما في ذلك الالحث (ه) من توقيت تكرار تأخر على كروموسوم X غير نشط بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في بعض خلايا السرطان والخلايا في تعرضوا للإشعاع المؤين عرض تأخير كبير في توقيت تكرار> 3 ساعات يؤثر على كروموسوم كامل 2،3. العمل الأخير من المختبر إلى أن تعطل منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول جسمية مواضع نتيجة لتكرار النمط الظاهري في أواخر غاية التي تؤثر على ال 4 كروموسوم كامل. دراسات 'الهندسة كروموسوم' إضافية تشير إلى أن إعادة ترتيب الكروموسومات معينة تؤثر على العديد من الكروموسومات نتيجة مختلفة في هذا النمط الظاهري النسخ المتماثل توقيت غير طبيعية، مما يدل على أن جميع الثدييات تحتوي على الكروموسومات منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول مواضع التي تتحكم السليم توقيت تكرار الكروموسومات الفردية 5.
هنا، نقدم طريقة لتحليل الكمي للتوقيت تكرار كروموسوم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت في الموقع التهجين. هذاالأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لتوقيت النسخ المتماثل بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية نفسها، وجرى تكييف في الفترة من 6. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحديد لا لبس فيه من إعادة ترتيب الكروموسومات التي ترتبط مع التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تؤثر على كروموسوم كامل. هذا الأسلوب له مزايا أكثر وضعت مؤخرا مجموعة صغيرة عالية الإنتاجية أو التسلسل البروتوكولات التي لا يمكن التمييز بين الأليلات مثلي على تقديم ترتيبها وإعادة ترتيبها من الامم المتحدة والكروموسومات. وبالإضافة إلى ذلك، لأن الأسلوب هو موضح هنا يقيم الخلايا واحدة، فإنه يمكن الكشف عن التغييرات في توقيت تكرار كروموسوم على إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في جزء فقط من الخلايا في السكان.
إعداد ينتشر الكروموسومات هي خطوة حاسمة لفحص النسخ المتماثل توقيت الناجحة الموصوفة هنا. قد إدراج خطوة المعالجة colcemid قبل العلاج ناقص التوتر مساعدة في تواتر ونشر الخلايا التفتلي. علينا أن نفضح عادة الخلايا لcolcemdi للموارد البشرية 1-3 قبل الحصاد، واستخدام colcemid عند تركيز ا?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للسرطان، CA131967.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |