Kromosom Replikere Timing Kombinert med fluoriserende<em> I situ</em> Hybridisering

Summary

En kvantitativ fremgangsmåte for analyse av kromosomreplikasjon timingen er beskrevet. Metoden utnytter BrdU inkorporering i kombinasjon med fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) for å vurdere replikering timing av pattedyr kromosomer. Denne teknikken gjør det mulig for direkte sammenligning av omorganiseres og un-rearrangerte kromosomer innenfor den samme cellen.

Abstract

Pattedyrs DNA replikasjon initierer på flere steder langs kromosomene til forskjellige tider i løpet av S-fasen, etter en temporal replikering program. Spesifisering av replikering timing er tenkt å være en dynamisk prosess regulert av vevsspesifikke og utviklingsmessige signaler som er mottakelig for epigenetic endringer. Men fortsatt mekanismene som regulerer hvor og når DNA replikasjon initierer langs kromosomene dårlig forstått. Homologe kromosomer vanligvis replikere synkront, men det er bemerkelsesverdig unntak til denne regelen. For eksempel, i kvinnelige pattedyrceller en av de to X-kromosomer blir sent replikerende gjennom en prosess kjent som X inaktivering ^1. Sammen med denne forsinkelsen i replikering timing, anslått til å være 2-3 timer, blir de fleste av gener transkripsjonelt taushet på ett X-kromosom. I tillegg regulerer en diskret cis virkende locus, kjent som X-inaktivering sentrum denne X inaktivering prosessen, inkludert the induksjon av forsinket replikering timing på hele inaktive X-kromosom. I tillegg er visse kromosom rearrangementer funnet i kreftceller og i celler eksponert for ioniserende stråling vise en betydelig forsinkelse i replikasjon timing av> 3 timer som påvirker hele kromosom ^2,3. Nyere arbeid fra vårt laboratorium tyder på at forstyrrelser av diskrete cis-fungerende autosomal loci resulterer i en ekstremt sent replikere fenotype som påvirker hele kromosom ^4. Ekstra "kromosom tekniske 'studier tyder på at visse kromosom rearrangements påvirker mange forskjellige kromosomer resultat i denne unormale replikering-timing fenotype, noe som tyder på at alle pattedyr kromosomer inneholder diskrete cis-virkende loci som styrer riktig replikering timing av enkelte kromosomer ^5.

Her presenterer vi en fremgangsmåte for kvantitativ analyse av kromosomreplikasjon timing kombinert med fluorescerende in situ hybridisering. Dettefremgangsmåte tillater en direkte sammenligning av replikering timing mellom homologe kromosomer innenfor samme celle, og ble tilpasset fra ^6. I tillegg gir denne metoden for entydig identifikasjon av kromosomale rearrangements som korrelerer med endringer i replikering timing som påvirker hele kromosom. Denne metoden har fordeler fremfor nylig utviklet høy gjennomstrømming microarray eller sekvensering protokoller som ikke kan skille mellom homologe alleler stede på omorganiseres og un-omorganisert kromosomer. I tillegg, fordi metoden beskrevet her evaluerer enkeltceller, kan det oppdage endringer i kromosomreplikasjon timing på kromosomale rearrangements som er tilstede i bare en brøkdel av de celler i en populasjon.

Protocol

1. BrdU Incorporation (Terminal Merking) Plate celler til omtrent 70% konfluens i en 150 mm vevskultur parabolen 24 hr før tilsetningen av BrdU. Erstatt medier med fersk komplette medier inneholdende 20 pg / ml BrdU (Sigma) på hensiktsmessige tidspunkter før høsting. Lengden av tid dyrkes cellene i medier med BrdU vil variere med celletype og arter, vanligvis G2 fasen varer mellom 2 og 5 timer (figur 1). 2. Kromosom Harvest of Monolayer Cells kul…

Representative Results

Et eksempel på replikering analyse timing for menneskets kromosom 6 er vist i figur 2. Celler som inneholder en sletting av ASAR6 genet 4, som ligger på 6q16.1, ble utsatt for BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandles for fisk med et kromosom 6 maling probe (Vysis) og for BrdU inkorporering. Merk at det er en betydelig forskjell i BrdU banding mønster mellom de to 6-ere, som er forenlig med en forsinkelse i replikasjon timing av> 2 t for en av kromosom 6 står [se <sup…

Discussion

Utarbeidelse av kromosom sprer er et kritisk punkt for vellykket replikering-timing analysen beskrevet her. Inkludering av en colcemid forbehandling trinn før hypoton behandling kan hjelpe til frekvens og spredning av mitotiske celler. Vi vanligvis eksponere cellene til colcemdi for 1-3 hr før høsting, og bruke colcemid ved en endelig konsentrasjon på 10 ug / ml. Imidlertid kan det inntas et colcemid forbehandling trinn endre varigheten G2 og dermed kan endre den tilsynelatende replikering timing og tilstand av kond…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 μg/μl
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varies
LSI/WCP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	MetaSystems Group	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope	Olympus	BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Digital Camera	Olympus	UCMAD3
			IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES Formamide Solutions 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamide* (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d2H20 pH to 7.0 with HCl (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH2O pH to 7.0 with HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH2O to volume PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): dH2O to volume 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) dH2O to volume. PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) 25 ml PN buffer (Recipe above) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.