Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente Published: December 10, 2012 doi: 10.3791/4400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University

Summary

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con fluorescente

Abstract

La replicación del ADN de mamíferos se inicia en varios sitios a lo largo de los cromosomas en diferentes momentos durante la fase S, siguiendo un programa de repetición temporal. La especificación de la sincronización de replicación se cree que es un proceso dinámico regulada por señales específicas de tejido y de desarrollo que son sensibles a las modificaciones epigenéticas. Sin embargo, los mecanismos que regulan dónde y cuándo se inicia la replicación del ADN a lo largo de los cromosomas sigue siendo poco conocida. Los cromosomas homólogos suele replicar de forma sincrónica, sin embargo, hay excepciones notables a esta regla. Por ejemplo, en células de mamífero hembra uno de los dos cromosomas X se convierte tarde replicación a través de un proceso conocido como inactivación X 1. Junto con este retraso en el tiempo de replicación, estimado en 2-3 horas, la mayoría de los genes se transcriptionally silenciados en un cromosoma X. Además, un discreto de acción en cis locus, conocido como el centro de la inactivación X, regula este proceso de inactivación X, incluyendo the inducción de la replicación de temporización retardada en el cromosoma X inactivo completo. Además, ciertos reordenamientos cromosómicos que se encuentran en las células cancerosas y en células expuestas a la radiación ionizante mostrar un retraso significativo en el tiempo de replicación de> 3 horas que afecta a todo el cromosoma 2,3. Trabajos recientes de nuestro laboratorio indican que la interrupción de discreta actuación cis resultado autosómica loci en un fenotipo de replicación muy tarde que afecta al 4 cromosoma entero. Estudios adicionales de ingeniería de cromosoma 'indican que los reordenamientos cromosómicos que afectan a los cromosomas diferente resultado, muchos en este momento la replicación anormal fenotipo, lo que sugiere que todos los cromosomas de mamíferos contienen discretas que actúan en cis loci que controlan la sincronización correcta replicación de los cromosomas 5.

Aquí, se presenta un método para el análisis cuantitativo de la replicación del cromosoma de temporización en combinación con hibridación in situ fluorescente. Estamétodo permite una comparación directa de la replicación de temporización entre cromosomas homólogos en la misma célula, y se adaptó a partir de 6. Además, este método permite la identificación inequívoca de los reordenamientos cromosómicos que se correlacionan con cambios en el plazo que afectan a la replicación de todo el cromosoma. Este método tiene ventajas sobre el reciente desarrollo de alto rendimiento micro-array o secuenciación protocolos que no pueden distinguir entre homólogos alelos presentes en reordenar y reorganizar un-cromosomas. Además, debido a que el método descrito aquí evalúa las células individuales, se puede detectar cambios en el tiempo de replicación en el cromosoma reordenamientos cromosómicos que están presentes en sólo una fracción de las células en una población.

Protocol

1. BrdU incorporación (denominación de los terminales)

  1. Células de la placa a aproximadamente 70% de confluencia en un cultivo de tejido de 150 mm plato 24 horas antes de la adición de BrdU.
  2. Sustitución de los medios por nuevos medios completos que contienen 20 mg / ml de BrdU (Sigma) en puntos de tiempo apropiados antes de la cosecha. La longitud de tiempo de las células se cultivan en medios con BrdU variará con el tipo celular y la especie, típicamente la fase G2 dura entre 2 y 5 horas (Figura 1).

2. Cromosoma cosecha de cultivos monocapa de células

  1. Eliminar los medios de cultivo de la placa y recoger 10 ml en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. Deseche los medios restantes.
  2. Enjuagar las células una vez con 10 ml versine [o HBSS (Sigma)].
  3. Añadir 5 ml de tripsina 0,25% en versine (o HBSS) a la placa. Incubar a temperatura ambiente hasta que las células se separan de la placa.
  4. Añadir suspensión de células se tripsinizaron al tubo que contiene los 10 ml de medios de paso 2,1. </ Li>
  5. Centrifugar a 400 xg durante 10 min para sedimentar las células. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular.
  6. Resuspender las células a fondo por pipeteo con una pipeta Pasteur.
  7. Añadir 3 gotas de solución hipotónica (0,075 M KCl (Sigma) se calentó a 37 ° C) y mezclar la suspensión de células con una pipeta Pasteur. Añadir 0,5 ml de solución hipotónica y se mezcla de nuevo con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de solución hipotónica a 5 ml y mezclar de nuevo. Incubar a 37 ° C durante 20-45 min, dependiendo del tipo de célula.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 ml de medio más el sedimento celular.
  9. Resuspender el pellet de células agitando suavemente el tubo. Las células osmóticamente hinchadas será frágil en este punto, por lo que se debe tener cuidado de no perturbar las membranas citoplasmáticas.
  10. Añadir 3 gotas de fijador (1:3 ácido acético glacial: metanol) Carnoy y mezcle suavemente con una pipeta Pasteur pipeteee. Añadir 0,5 ml de fijador y mezclar pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Llevar a un volumen de fijador a 5 ml y mezclar de nuevo pipeteando suavemente con una pipeta Pasteur. Las células fijadas se pueden almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante varios meses.
  11. Centrifugar y aspirar como en el paso 2,8.
  12. Resuspender el sedimento celular en fijador fresco; estimar el volumen de la pastilla y añadir 10 veces el volumen de ~ fijador de Carnoy.
  13. Añadir la suspensión celular gota a gota en portaobjetos de microscopio húmedos, helados; mantener el portaobjetos a un ángulo de ~ 45 ° y permitir la suspensión de células a fluir sobre la superficie del portaobjetos. Coloque la corredera plana sobre papel de cocina y el diluvio de diapositivas con fijador y dejar secar al aire. Ver diapositivas para la presencia de los diferenciales mitóticas usando un microscopio invertido.

3. RNasa tratamiento y deshidratación de etanol

  1. Place 200 l de 10 mg / ml de RNasa A (Sigma) en 2 x SSC a cada diapositiva; incubar a 37 y deg; C durante 1 hr.
  2. Lavado de los portaobjetos 3 veces con 2X SSC, pH 7,0 a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  3. Deshidratar desliza a través de una EtOH (Sigma) serie (70%, 90% y% 100) a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  4. Secar las preparaciones a temperatura ambiente.

4. Preparación de cócteles Probe Plus para BAC centrómero del cromosoma específico Enumeración Probe (CEP) o para las pinturas de cromosomas enteros Hibridación in situ

  1. Para la hibridación BAC / PAC simultánea, preparar dos cócteles sondas separadas para pre-hibridación. Hemos encontrado que la pre-hibridación de las sondas de BAC y PAC por separado en los resultados de rigurosidades diferentes en menos de fondo y una mayor intensidad de señal. También hemos encontrado que fosmids individuales también se pueden utilizar en lugar de clones BAC. La formulación cóctel se describe a continuación representa los volúmenes para una sola diapositiva. Si el procesamiento de varias diapositivas utilizando las mismas sondas simplemente aumentar el parámetro adecuado volúmenes iately.

    * BAC ADN sonda cóctel:

    11,5 l de tampón de hibridación (50% formamida (Sigma) / 2 x SSC / sulfato de dextrano (Sigma)) 2 l dH 2 O

    2,5 l BAC/Cot1 ADN en dH 2 O (ver más abajo para el etiquetado de protocolo) 15 l volumen total

    * CEP sonda cóctel:

    7 l CEP tampón de hibridación (65% Formamide/2x SSC / sulfato de dextrano) 2 l dH 2 O

    1 l de ADN CEP/Cot1 (comprado prelabeled con Spectrum Orange/Cy3/Texas Rojo) 10 l volumen total

    * Después de la desnaturalización y pre-hibridación (paso 5.1) Mezcla de BAC sonda con CEP sonda en una relación 3:2 25 cócteles sonda l / diapositivas y mezclar.

    Oregón

  2. Alícuota de 20 l / portaobjetos de sonda completo con Paint cromosoma (Cy3/Texas Red) en un tubo. Proceder a la desnaturalización y la etapa de pre-hibridación.
"> 5. Deslice y desnaturalización de la sonda y la hibridación in situ

  1. Desnaturalizar la sonda cóctel (s) a 75 ° C durante 10 min. Pre-hibridación a 37 º C durante 30 min para permitir que el ADN de Cot1 para hibridar con secuencias repetitivas y para evitar la hibridación subsiguiente a cromosomas en metafase.
  2. Diapositivas desnaturalizar en frascos Coplin en Formamide/2x 70% SSC, pH 7,0 a 72 ° C durante 3 min.
  3. Inmediatamente deshidratar desliza a través de una serie de EtOH (70%, 90% y% 100) en frascos Coplin a 4 ° C durante 3 min cada uno.
  4. Deje que los portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente.
  5. Precalentar diapositivas a 45 ° C en la diapositiva más cálido de los últimos 10 minutos de la sonda de pre-La hibridación (paso 5.1). Mezclar pre-hibridizada cóctel sonda si es necesario y añadir 25 ul para cada diapositiva, coloque suavemente un cubreobjetos en cada diapositiva y el sello a lo largo de todos los bordes con cemento de goma. Incubar durante una noche a 37 ° C en una cámara humidificada para evitar la evaporación.

  1. Lavar los portaobjetos en frascos Coplin 3 veces en formamide/2x 50% SSC, pH 7,0, a 38-40 ° C durante 3 min cada uno. La temperatura de los lavados puede variar entre las sondas. Si no hay hibridación de fondo alta puede aumentar la temperatura de los lavados. A la inversa, si la señal es débil y no existen antecedentes entonces se puede disminuir la temperatura de estos lavados.
  2. Lavar los portaobjetos una vez en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min, y pasar a la etapa de detección de BrdU.

7. BrdU detección

  1. Diapositivas de bloques con tampón de PNM durante 10 min (200 l / portaobjetos) a temperatura ambiente en la oscuridad.
  2. Escurrir las diapositivas mediante la activación de borde sobre una toalla de papel. Añadir 100 l de anti-BrdU-FITC (50 mg / ml o Millipore Roche) en tampón de PNM durante 30 min a 37 ° C.
  3. Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón de PN a temperatura ambiente durante 3 min cada uno.
  4. Drenarel exceso de tampón de PN en portaobjetos de uno a la vez girando en el borde en una toalla de papel. Añadir 20 l DAPI / Antifade solución de montaje (Invitrogen). Cubrir el portaobjetos con una toalla de papel y presione el cubreobjetos para forzar la salida de burbujas de aire y el exceso de solución de montaje. Continúe con el análisis de imágenes.

8. La captura de imágenes y cuantificación de incorporación de BrdU

  1. Las imágenes se capturan con una Olympus BX61 microscopio de fluorescencia Olympus y la cámara CCD, 100x objetivo, rueda de filtros automáticos y software Cytovision (Applied Imaging). BrdU es capturado utilizando un filtro FITC; pinturas cromosoma (Texas Red, metasistemas o Cytocell), BAC (Cy3) y sondas de CEP (Vysis Spectrum Orange) se capturaron con una Red de Texas o el filtro de Cy3; DAPI se capta con un filtro DAPI (véase Las figuras 2 y 3).
  2. Cromosomas individuales de interés se identifican con BAC / PAC cromosoma o sondas específicas de pintura (Figuras 2B y 3B). Utilizandoel software Cytovision, cada cromosoma de interés es de "corte" de la propagación de metafase como un todo, se traza una línea a través del largo de la longitud del cromosoma de brazo corto de brazo largo (figuras 2C y 3C). El software Cytovision se utiliza para cuantificar el perfil de intensidad de los píxeles a lo largo de la longitud de cada cromosoma. El software Cytovision calcula el área ocupada por los píxeles y se cuantifica la intensidad de los píxeles representados por los BrdU o DAPI señales en cada cromosoma aislado. La intensidad de los píxeles promedio representada por cada cromosoma se multiplica por el área ocupada por los píxeles para obtener el número total de pixeles (Tabla 1 y Figura 4). Además, este protocolo permite la visualización de las últimas regiones de replicación de los cromosomas. En consecuencia, el patrón de bandas de incorporación de BrdU permite la detección de regiones de replicación activa de los cromosomas, y diferencias en el momento de replicación entre chromospares OMe se ve como diferencias en este patrón de bandas (Figuras 2 y 3). Por último, estas diferencias en los patrones de unión se puede comparar con conocidos mapas de replicación de tiempo para cada cromosoma 6,7, lo que permite una estimación de la diferencia de tiempo de replicación entre cromosomas homólogos o los brazos del cromosoma 4. Por ejemplo, el cromosoma dos 6 es en la Figura 3A muestran una diferencia en el patrón de bandas de> 2 hr cuando se compara con la temporización normal de replicación del cromosoma 6 4.
    Además, un procedimiento similar al descrito aquí se ha utilizado con éxito para el estudio de la replicación asíncrona de temporización entre los cromosomas X inactivo y activo 8,9. Los cromosomas X activos e inactivos se identificaron utilizando pinturas cromosoma X. Las imágenes se adquirieron usando Quips mFISH software (Vysis) y el número de píxeles ocupados por los cromosomas X y el número de píxeles ocupados por la fluorescenciabeled BrdU fueron calculados utilizando NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Traducción de BAC ADN de etiquetado fluorescente (Vysis)

  1. Agregue la mezcla de sondas siguiente a un tubo de microcentrífuga refrigerada:
    70 l (4 g de ADN) en dH 2 O
    10 l 0,2 mM dUTP-Naranja o Verde
    20 l .1 mM dTTP
    20 l 10x tampón de traducción Nick
    40 l NT dNTP (menos dTTP)
    40 l nick enzima Traducción
    Volumen total 200 l
    Incubar @ 16 ° CO / N. Detener la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 10 min. Enfriar en hielo durante 5 min.
  2. Se precipita el ADN con etanol añadiendo lo siguiente a la mezcla de sondas:
    200 l solución de sonda
    48 l 3 M NaOAc
    160 l Cot1DNA (.25 mg / ul)
    1.200 l de EtOH 100%
  3. Almacenar a -80 º C durante 10 min a O / N.
  4. Girar in frío a 12.000 xg durante 20 min. Decantar EtOH. Lavar 1 vez con 70% EtOH. Girar como antes. Decantar EtOH. Deje secar al aire sólo hasta que se evapore EtOH. Resuspender en 40 l dH 2 O para una concentración final de 100 ng / l de ADN de BAC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un ejemplo del análisis de tiempo de replicación para el cromosoma 6 humano se muestra en la Figura 2. Las células que contienen una deleción del gen ASAR6 4, que se encuentra en 6q16.1, fueron expuestos a BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y para peces con una sonda de cromosoma pintura 6 (Vysis) y para la incorporación de BrdU. Observe que no hay una diferencia significativa en el patrón de BrdU de bandas entre los dos 6, que es coherente con un retraso en el tiempo de replicación de> 2 h para uno de el cromosoma 6 [ver 4 para la sincronización de replicación patrón de bandas del cromosoma 6 antes la supresión]. Además, hay una diferencia significativa en la cantidad total de incorporación de BrdU (píxeles) cuando se compara con un análisis similar de la tinción con DAPI (Figura 2D).

Otro ejemplo de análisis de tiempo de la replicación para el cromosoma humano 6 se muestra en la Figura 3. Las células que contienen el same deleción del gen ASAR6 4 muestra si la Figura 2 se expusieron a BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y se procesaron para FISH con una sonda de cromosoma 6 CEP más un BAC que contiene el gen ASAR6 y para la incorporación de BrdU. Tenga en cuenta que el cromosoma suprimido 6 (Δ6) muestra más la incorporación de BrdU y un patrón más amplio de bandas de incorporación BrdU que el cromosoma no suprime 6. Diferenciales mitóticas de 7 diferentes células fueron procesados ​​como en la Figura 3 y los perfiles de píxeles para ambos DAPI y BrdU se muestra en la Tabla 1.

Figura 1
Figura 1. BrdU terminal de concesión de etiqueta. Una fase S en células de mamífero típica una duración de 8 a 10 h, y G2 es típicamente de 2 a 5 horas. BrdU se agrega para aumentar los períodos de tiempo (flechas verdes) para etiquetar las últimas porciones de los cromosomas para replicar. Thcromosomas e replicar en células de mamífero de acuerdo con un programa temporal, con la replicación temprana y tardía ocurre al principio y al final de la fase S, respectivamente (línea de color negro). Cromosomas X inactivo se retrasan en el tiempo de replicación con la mayoría de la síntesis de ADN ocurre durante la segunda mitad de la fase S (línea azul). Los cromosomas con sincronización de replicación tardía se demoran tanto en la iniciación y terminación de la síntesis de ADN, con replicación activa continuando a través de G2 (línea roja). Culturas asíncronos se cosechan las células mitóticas y procesados ​​para su incorporación BrdU y FISH.

Figura 2
Figura 2. Replicación asíncrona del cromosoma humano 6. Las células que contienen una deleción del gen de la ingeniería ASAR6 4 se trataron con BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y se procesan para la incorporación de BrdU y FISH utilizando un chrom Osome 6 pintura como sonda. El ADN se tiñeron con DAPI (azul). A) Una extensión mitótica que contiene un típico "bandas" modelo de incorporación de BrdU (verde) se muestra. El cromosoma 6 sonda pintura hibrida con dos cromosoma 6 (rojo) en esta celda. B) El cromosoma 6 de dos (I y II) fueron "cortar" y se muestra con los tres marcadores fluorescentes separados en imágenes distintas. C) El cromosoma 6 se analizaron usando el software Cytovision y los perfiles de intensidad de señal para ambos DAPI (azul) y BrdU (verde) son mostrados. La línea roja indica la ruta de acceso utilizada, de brazo corto (p) para el brazo largo (q) para la cuantificación de ambos BrdU y DAPI. La distancia se refiere a la longitud de cada cromosoma de brazo corto (p) para el brazo largo (q) en píxeles. D) Cuantificación de la señal total para ambos DAPI y fluorescencia BrdU. Los valores totales representan la intensidad de los píxeles promedio multiplicado por el área representada por los píxeles.

igura 3 "src =" / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg "/>
Figura 3. Tardía replicación del cromosoma humano 6 que contiene una deleción de ASAR6. Las células que contienen una deleción del gen de la ingeniería ASAR6 4 se trataron con BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y se procesan para la incorporación de BrdU y FISH usando un cromosoma 6 CEP más un BAC que contiene el gen ASAR6 como sondas. El ADN se tiñeron con DAPI (azul). A) Una extensión mitótica que contiene un típico "bandas" modelo de incorporación de BrdU (verde) se muestra. El cromosoma 6 CEP sonda hibridada con dos cromosomas 6 de (gran señal centromérica rojo), y el BAC hibridó a un solo cromosoma 6 (pequeña señal roja en el brazo largo) en esta celda. Obsérvese la diferencia en el patrón de bandas BrdU entre los dos de 6. B) El cromosoma eliminada 6 está representado por la Δ6 y 6 no eliminada por 6. 6 Los dos fueron "cortar" y se muestra con los tres marcadores fluorescentes separados en imágenes distintas. C) Tél cromosoma 6 se analizaron usando el software Cytovision y los perfiles de intensidad de señal para ambos DAPI (azul) y BrdU (verde) son mostrados. La línea roja indica la ruta de acceso utilizada, de brazo corto (p) para el brazo largo (q) para la cuantificación de ambos BrdU y DAPI. La distancia se refiere a la longitud de cada cromosoma de brazo corto (p) para el brazo largo (q) en píxeles. D) Cuantificación de la señal total para ambos DAPI y fluorescencia BrdU. Los valores totales representan la intensidad de los píxeles promedio multiplicado por el área representada por los píxeles.

Figura 4
Figura 4. La cuantificación de la diferencia de tiempo de replicación entre el cromosoma 6 de. Las células que contienen una deleción del gen de la ingeniería ASAR6 4 se trataron con BrdU durante 5 h, se recogieron las células mitóticas y se procesan para la incorporación de BrdU y FISH utilizando una sonda de cromosoma 6 CEP más unBAC que contiene el gen ASAR6 como sonda. Diferenciales mitóticas fueron procesados ​​como en la Figura 3 y los valores de 7 células diferentes se muestran (ver tabla 1). A) La tinción con DAPI y se cuantificó el número total de píxeles se muestra para cada célula. Tenga en cuenta que sólo hay diferencia ~ 10-20% entre los cromosomas dentro de la misma célula. B) La incorporación de BrdU se cuantificó a partir de los mismos cromosomas que el panel B arriba. Observe que no es> 2 veces la diferencia entre los valores de píxeles totales para el cromosoma 6 eliminada y no eliminada-de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La preparación de extensiones de cromosomas es un paso crítico para el éxito de la replicación de temporización ensayo descrito aquí. La inclusión de una etapa de pretratamiento antes de la colcemid tratamiento hipotónico puede ayudar en la frecuencia y la propagación de las células mitóticas. Nos típicamente exponer las células a colcemdi de 1-3 h antes de la cosecha, y el uso colcemid a una concentración final de 10 ug / ml. Sin embargo, la inclusión de una etapa de pretratamiento colcemid puede alterar la longitud de G2 y en consecuencia puede alterar el tiempo de replicación aparente y el estado de la condensación de los cromosomas 3.

Este procedimiento se puede aplicar a muchos tipos de células diferentes y especies mediante la variación de la duración de la incubación con BrdU, que depende de la duración del ciclo celular. Para la mayoría de las líneas celulares humanas y de ratón, la fase G2 es típicamente 3-6 hr, por lo tanto, los tratamientos de BrdU están típicamente en este intervalo. Una alternativa a la BrdU es 5-etinil-2'deoxyuridine (EDU) y su posterior detección utilizandouna azida fluorescente y "química click" reacción 10. El esquema de detección EdU tiene varias ventajas sobre el esquema de detección de BrdU. Por ejemplo, la detección de EdU no requiere la fijación de la muestra o desnaturalización del ADN. Así, el uso de EdU a la sincronización de replicación asnos se puede combinar con sencillas técnicas de bandeo G-en lugar de pescado para identificar los cromosomas de interés.

El protocolo de sincronización de replicación descrito aquí está diseñado específicamente para ensayo de fase S tardía más cualquier síntesis de ADN se extiende en G2. Además, la replicación del ADN se puede supervisar a través de la fase S mediante este procedimiento mediante cortas (15-30 min) pulsos de BrdU seguidos de períodos relativamente largos de persecución 6-10 hr. Esto permite la visualización de la incorporación de BrdU en tanto temprana y media de la fase S. Por ejemplo, ciertos tumorales derivadas reordenamientos cromosómicos se retrasa tanto en la iniciación y terminación de la síntesis de ADN a lo largo de toda la longitud de los cromosomas 3

Una ventaja de este procedimiento es que el tiempo de replicación de temporización replicación lo ensayos en células individuales. Por lo tanto, tiene la capacidad de detectar diferencias en el momento de replicación entre cromosomas homólogos contenidas dentro de la misma célula. Aunque hay otros procedimientos, por ejemplo. tiempo de replicación de hibridación in situ (ReTiSH; 11), que tienen la capacidad de detectar diferencias en el momento de replicación entre alelos en loci específicos en cromosomas homólogos, el procedimiento aquí descrito puede detectar diferencias en el tiempo de replicación a lo largo de toda la longitud de los cromosomas. Además, este procedimiento puede diferencias de ensayo en el tiempo de replicación de los cromosomas que están presentes en sólo una fracción de las células de una población 3. Por ejemplo, numerosas líneas celulares de cáncer y muestras de tumores primarios contienen reordenamientos cromosómicos que están presentes en menos del 50% de las células. Actualmente estamos utilizando este procedimiento de ensayo en los cromosomasen muestras de tumores primarios, y han sido capaces de detectar la replicación asíncrona entre los cromosomas en múltiples muestras. Sin embargo, dado que las muestras de tumores primarios tienen un número limitado de figuras mitóticas, aproximadamente un tercio de los cultivos primarios no dio un número suficiente de los diferenciales mitóticas.

Otra ventaja que este procedimiento tiene más de microarray o ensayos basados ​​en la secuenciación es que los cromosomas individuales se someten a ensayo en lugar de ADN inmunoprecipitado a partir de grupos de células. En los ensayos basados ​​en la inmunoprecipitación-polimorfismos deben ser identificados y relacionados con alelos específicos con el fin de distinguir el tiempo de replicación entre alelos.

Además, con el reconocimiento de que muchas células cancerosas contienen numerosas reordenamientos cromosómicos 12, y la observación de que el estrés replicación del ADN está asociada con la inestabilidad genómica en 13 células de cáncer, creemos que este protocolo es una f herramienta útil y sencillao el análisis de rutina de la sincronización de replicación de los cromosomas en las células de cáncer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer, CA131967.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1
Digital Camera Olympus UCMAD3

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from: http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman (2006).
  13. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Tags

Genética Número 70 Bioquímica Biología Molecular Biología Celular oportunidad replicación del cromosoma fluorescente FISH BrdU citogenética reordenamientos cromosómicos microscopía de fluorescencia
Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, L., Thayer, M. Chromosome… More

Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter