Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.
Kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) zijn de voornaamste celtype in de tumorstroma van vele soorten kanker, in het bijzonder borstkanker, en de prominente aanwezigheid wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose 1,2. CAF zijn een geactiveerd subpopulatie stromale fibroblasten, waarvan vele drukken de myofibroblast marker α-SMA 3. CAF afkomstig zijn van plaatselijke weefsel fibroblasten en van beenmerg afgeleide cellen gerekruteerd voor de ontwikkeling en tumor CAF fenotype onder invloed van de tumor micro 4 nemen. CAF werd aangetoond dat de tumor initiatie, groei en vooruitgang te bevorderen door middel van signalering dat bevordert tumorcelproliferatie, angiogenese en invasie 5-8. We hebben aangetoond dat CAF tumor groei door bemiddeling tumor-bevorderende ontsteking, vanaf de eerste stadia preneoplastisch 9. Ondanks de toenemende bewijs van de belangrijke rol CAF spelen in het faciliteren van de groei van tumoren,bestuderen CAF is een permanente uitdaging vanwege het ontbreken van CAF-specifieke markers en de enorme heterogeniteit van deze cellen met vele subtypen coëxisterende in de tumor micro-omgeving 10. Bovendien onderzoekt fibroblasten in vitro belemmerd door het feit dat hun genexpressieprofiel vaak veranderd in weefselkweek 11,12. Om dit probleem aan te pakken en onpartijdige genexpressie van fibroblasten van verse muis en menselijke weefsels mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld op basis van eerdere protocollen voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 13,14. Onze aanpak is gebaseerd op het benutten van PDGFRα als een oppervlak marker om fibroblasten te isoleren van verse muis en menselijk weefsel. PDGFRα is overvloedig uitgedrukt door zowel de normale fibroblasten en CAF 9,15. Deze methode maakt isolatie van zuivere populaties van normale fibroblasten en CAF, inclusief maar niet beperkt tot α-SMA + geactiveerd myofibroblasten. Fibroblasten geïsoleerd kunnen danvoor karakterisering en vergelijking van de ontwikkeling van genexpressie die optreedt in CAF tijdens tumorigenese. Sterker nog, wij en anderen gemeld expressie profilering van fibroblasten geïsoleerd door celsortering 16. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en hoogverrijkt populaties van fibroblasten profiel van de huid, borstklier, pancreas en longen. Bovendien maakt onze methode ook kweken van cellen gesorteerd, om functionele experimenten en verontreiniging door tumorcellen, die vaak een groot obstakel wanneer het proberen om cultuur CAF voorkomen.
Terwijl experimenten uitgevoerd in weefselkweek kan informatief en suggereren functionele principes die kunnen worden geverifieerd in vivo is bekend dat grote veranderingen in genexpressie van cellen in kweek 11,12. Om een weefselkweek stap vermijden wanneer genexpressie profilering in fibroblasten, ontwikkelden we een protocol waarmee Isolatie van normale, evenals kanker geassocieerde fibroblasten van verse muis of menselijk weefsel. Dit protocol werd met succes toegepast met de huid, pancreas…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken dr. Jitschak Oschry en Dr Orit Sagi-Asif voor hun hulp bij FACS sortering. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan NE van de Europese Unie zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. [276890], van het Israël Cancer Association (# 20110078), en van de Israëlische Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM | Gibco | 41965 | |
PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
PharmLyse | BD | 555899 | |
Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |