Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.
Associadas câncer fibroblastos (FAC), são o tipo de célula mais proeminente dentro do estroma tumoral de muitos cancros, em particular, carcinoma da mama, e a sua presença é muitas vezes associada proeminente com 1,2 prognóstico pobre. FAC são uma subpopulação de fibroblastos estromais activadas, muitos dos quais expressam o marcador de miofibroblastos α SMA-3. FAC originam a partir de fibroblastos dos tecidos locais, bem como a partir de medula óssea derivadas de células recrutadas para o tumor em desenvolvimento e adoptar um fenótipo CAF, sob a influência do microambiente do tumor 4. FAC foram mostrados para facilitar a iniciação do tumor, crescimento e a progressão através de sinalização que promove a proliferação de células de tumor, angiogénese e invasão 5-8. Nós demonstramos que a FAC aumentar o crescimento do tumor através da mediação de tumor promover a inflamação, a partir das primeiras fases de pré-neoplásicas 9. Apesar das evidências cada vez maior das FAC papel crucial na facilitação do crescimento tumoral,FAC estudam tem sido um desafio em curso, devido à falta de marcadores específicos do CAF ea heterogeneidade vasta destas células, com muitos subtipos co-existentes no microambiente do tumor 10. Além disso, estudos de fibroblastos in vitro é dificultado pelo facto de o seu perfil de expressão do gene é muitas vezes alterados em cultura de tecido 11,12. Para resolver este problema e permitir que o perfil de expressão gênica de imparcial fibroblastos de rato fresco e tecidos humanos, foi desenvolvido um método baseado em protocolos anteriores de fluorescência Ativado separação celular (FACS) 13,14. A nossa abordagem baseia-se na utilização PDGFRα como um marcador de superfície para isolar fibroblastos de rato fresca e tecidos humanos. PDGFRα é abundantemente expresso por ambos os fibroblastos normais e cafs 9,15. Este método permite o isolamento de populações puras de fibroblastos normais e cafés, incluindo, mas não limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos isolados podem então serutilizados para a caracterização e comparação da evolução da expressão do gene que ocorre no FAC durante a tumorigénese. Na verdade, nós e outros relataram perfil de expressão de fibroblastos isolados pela classificação celular 16. Este protocolo foi realizado com sucesso em isolar e perfil populações altamente enriquecido de fibroblastos dos tecidos da pele, pâncreas, mama e pulmão. Além disso, o nosso método também permite que a cultura de células seleccionadas, a fim de realizar experiências funcionais e para evitar a contaminação por células tumorais, o que é muitas vezes um grande obstáculo ao tentar FAC cultura.
Embora experiências efectuadas em cultura de tecidos podem ser informativas e sugerem princípios funcionais que podem ser verificadas in vivo, que se sabe que ocorrem grandes mudanças na expressão de genes de células em cultura 11,12. A fim de evitar uma etapa de cultura de tecido, quando o perfil de expressão de genes em fibroblastos, foi desenvolvido um protocolo que permite o isolamento dos normais, bem como as associadas câncer fibroblastos de rato fresco ou de tecido humano. Este protocol…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Yitzchak Oschry e Dr. Orit Sagi-Asif por sua ajuda com a classificação FACS. Esta pesquisa foi suportada por concessões para a NE do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob subvenção n ° [276890], a partir da Israel Cancer Association (# 20110078), e da Israel Cancer Research Fund (Investigação Prémio Carreira de Desenvolvimento).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM | Gibco | 41965 | |
PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
PharmLyse | BD | 555899 | |
Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |