Summary
Рак Associated фибробластов (CAFS) содействие раковых клеток, рост и прогрессию через понять, что способствует пролиферации, ангиогенеза и воспаления. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать чистые популяции нормальных фибробластов и CAFS из свежих мышиных и человеческих тканей сортировки клеток, используя PDGFRα как поверхность маркером.
Abstract
Рак связанных фибробластов (CAFS) являются наиболее видных типа клеток в опухоли стромы многих видов рака, в частности рака молочной железы, и их заметное присутствие часто ассоциируется с плохим прогнозом 1,2. CAFS являются активированный субпопуляции стромальных фибробластов, многие из которых выражают миофибробластов маркера α-SMA 3. CAFS происходят из местных фибробластов ткани, а также из костного мозга клеток, полученных работу в развивающиеся опухоли и принять фенотип CAF под влиянием микроокружения опухоли 4. CAFS были показаны для облегчения раковых клеток, рост и прогрессию через сигнализацию, которая способствует пролиферации опухолевых клеток, ангиогенез, и вторжение 5-8. Мы показали, что CAFS повышения роста опухоли посреднические опухоли, способствующих образованию воспалений, начиная с самой ранней предварительной стадии опухолевого 9. Несмотря на растущие доказательства из ключевых CAFS роль играет в обеспечении роста опухоли,изучение CAFS была текущие проблемы в связи с отсутствием CAF-специфических маркеров и подавляющее неоднородность этих клеток, при этом многие подтипы сосуществующих в опухоли микроокружения 10. Кроме того, изучение фибробластов в пробирке затруднено тем, что их профиль экспрессии генов часто изменен в культуре ткани 11,12. Чтобы решить эту проблему и обеспечить беспристрастный профилирования экспрессии генов фибробластов из свежей мыши и тканей человека, мы разработали метод, основанный на предыдущих протоколов для флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) 13,14. Наш подход основан на использовании PDGFRα как поверхностный маркер, чтобы изолировать фибробласты из свежих мышиных и человеческих тканей. PDGFRα обильно выражается как нормальные фибробласты и CAFS 9,15. Этот метод позволяет выделения чистых популяций нормальные фибробласты и CAFS, в том числе, но не ограничиваясь α-SMA + активированный миофибробласты. Изолированные фибробласты могут бытьиспользуется для описания и сравнения эволюции экспрессии генов, которая происходит в течение CAFS опухолей. В самом деле, мы и другие сообщили профиля экспрессии фибробластов выделяют сортировки клеток 16. Этот протокол был успешно проведен, чтобы изолировать и профилю высоко обогащенного популяции фибробластов из кожи, молочной железы, поджелудочной железы и легких тканей. Кроме того, наш метод позволяет также культивирование отсортированных клеток, в целях выполнения функциональных экспериментов и, чтобы избежать загрязнения опухолевыми клетками, которые часто большим препятствием при попытках культуры CAFS.
Protocol
1. Пройдя молочной или ткани кожи у мышей
- До рассечения тканей желаемое от мышей, подготовить следующие материалы и реактивы:
Поставки:
- Хирургия инструментов (промыть моющим средством, а затем погружают в 70% этанола).
- Пенополистирол поверхность, чтобы отдохнуть мыши во время вскрытия.
- Пальцы или иглы провести мышей во время вскрытия.
- Стеклянная банка с крышкой для переваривания пищи, содержащей магнитной мешалкой (автоклавного).
- Водяной бане при 37 ° C, содержащие погружные магнитной мешалкой и достаточно воды, чтобы затопить пищеварения банку, во время отдыха на мешалки.
Реагенты:
- FACS буфера I: (4 ° C): фосфат Дульбекко буферный раствор CMF (Кальций Магний бесплатно) + 0,5% BSA
- Коллагеназы решение (сделанные непосредственно перед употреблением):
0,05 г коллагеназы II
0,05 г коллагеназы IV
0,01 г дезоксирибонуклеазы
20FACS мл буфера I. Держите раствором коллагеназы на льду до использования. - PharmLyse (хлористого аммония Лизирующий реагентов).
- FACS буфера II: фосфат Дульбекко буферный раствор CMF + 1% FCS.
- Препарирование молочных желез (см. также 17).
- Усыпить самок мышей с использованием диоксида углерода (CO 2) ингаляции.
- На поверхности пенополистирола, поместите курсор на спине и пин-код твердо всех четырех конечностей с использованием 25 калибровочных иглы (рис. 1А). Спрей мыши щедро с 70% этанола.
- Используя щипцы, подтянуть кожу с живота по срединной линии и сделать небольшой разрез с острыми ножницами.
- Начиная с разрезом, разрезать кожу до шеи животного, избегая проколов брюшной или грудной полости.
- Разрежьте кожу на задних ногах от средней линии разреза на ноге, в результате чего "Y формы".
- Снимите кожу от корпуса мыши и придавить, подвергаямолочной железы прикреплены к нижней кожи (рис. 1б).
- Использование Q-Tips, чтобы аккуратно отделить молочных желез с кожи во время резки соединительной ткани с небольшими острыми ножницами, чтобы отделить молочной железы по направлению к позвоночнику мыши.
- Брюшной железы (# 4, 5) являются лучшими для этого протокола. Вы также можете использовать 2-й молочной железы, но имейте в виду, что эти железы анатомически расположен в непосредственной близости к грудной мышцы, которая может быть трудно отделить, в результате чего клетки смешанного происхождения ткани.
- Примечание: При рассекает ткани опухоли, рекомендуется для удаления некротической регионов.
- Препарирование тканей кожи: Самый простой способ получить ткани кожи, без необходимости иметь дело с удаления волос заключается в использовании мыши уши. Если большее количество ткани требуется, можно сбрить волосы от мыши туловища и рассекают кожу.
- Усыпить мышей с использованием CO 2 ингаляции.
- Используя острые ножницы, отрезал оба уха и место сразу в пищеварении сосуд небольшого объема (~ 0,5 мл) PBS на льду.
2. Подготовка молочных желез / кожа суспензии отдельных клеток
- Поместите молочных желез / кожи в пищеварении сосуд небольшого объема PBS на льду. Если ткань кровавый мытья x2 с PBS, а затем удалите избыток PBS.
- Фарш тщательно с изогнутыми ножницами.
- Добавить 20 мл раствором коллагеназы (примечание: это количество коллагеназы решение будет эффективно диссоциирует около 5 г молочных или опухолевой ткани и уши от до 15 мышей).
- Поместите сразу на перемешайте пластины в 37 ° С водяной бане, и инкубировать в течение 15 мин при перемешивании при средней скорости.
Примечание: оптимальное время инкубации может меняться, если переваривания других тканей.
- Чтобы остановить реакцию, добавить 30 мл холодной DMEM + 10% FCS.
- Процедить ткани / СМИ смеси Througга 70 мкм ячейки фильтра размещены на верхней части 50 мл коническую трубку.
- Центрифуга коническую трубку в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.
3. Эритроцитов Лизис
Примечание: этот шаг не является необходимым, если мышей сердце перфузию PBS, прежде чем они были принесены в жертву.
- Аспирируйте супернатанта с помощью стеклянной пипетки прикреплены к вакуум, не нарушая осадок клеток.
- Для лизиса эритроцитов, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл раствора PharmLyse и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
- Нейтрализовать PharmLyse решение, добавив примерно 40 мл FACS буфера I.
- Побочные коническую трубку с клетками в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант.
4. Блокировка Эндогенные Fc
- Дополнительно: количество клеток, чтобы определить соответствующий объем для следующего шага.
- Ресуспендируют клеток в 1-3 мл FACS буфера I (в зависимости оп число клеток, а количество антител вы хотите использовать).
- Добавить FcBlock (анти-мышь CD16/CD32), чтобы достичь разведение 1:50 (10 мкг / мл) и инкубировали на льду в течение 10-20 ".
Не нужно смывать FcBlock.
5. Окрашивание
- Возьмите 100 мкл аликвоты в Эппендорфа для использования в качестве не-окрашенных контроля и управления одного цвета (в зависимости от количества флуоресцентных антител используется).
- Для этикетке фибробластов: добавить анти-PDGFRα (непосредственно сопряженных с флуорофором) в разведении 1:50 (10 мкг / мл).
- Для обозначения других клеточных популяций (например, клетки иммунной системы, макрофаги, эндотелиальные клетки и т.д.): добавить соответствующие флуоресцентно антителами на поверхности маркеров, чтобы разведение 1:50.
Примечание: хотя PDGFRα является надежным маркером для фибробластов, рекомендуется включить антител для иммунных клеток, и для эпителиальных клеток, с тем чтобы исключить любое двойное положительноенаселение и тем самым повысить чистоту изолированных фибробластов.
- Добавить 2 мкл каждого антитела к каждому из одного цвета контроля труб Эппендорф.
- Инкубируйте клеток с антителами в течение 1 часа на льду в темноте.
- Для мытья: заполнить трубы с FACS буфера я и спина в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.
- Супернатант, ресуспендируют клеток в буфере FACS я до концентрации примерно 2 х 10 6 клеток / мл, или любой концентрации наиболее подходящий для сортировки с доступной сортировщик FACS.
Дополнительно: Ячейки могут быть ресуспендировали в FACS буфера II на время сортировки. Это может улучшить жизнеспособность клеток. Тем не менее, воздействие факторов в сыворотке крови может быть выражением эффекта гена, которые должны быть проверены и приняты во внимание.
- Передача меченых клеток в FACS трубы с фильтром сверху: фильтр клеток в трубы, чтобы предотвратить клетки сгустки.
- Чтобы исключить мертвые клетки, добавьте 7AAD (0,5 мкг / мл) или Propidium йодида (PI) для образцов (за исключением ООН окрашенных управления).
Примечание: Чтобы избежать ненужной траты клеток, вы можете добавить 7AAD/PI в ООН окрашенных образцов после записи в FACS, и использовать снова, как 7AAD только для контроля.
- Храните образцы на льду при анализе.
6. Выделение клеток путем FACS
(Примечание: эта часть протокола требуется знание операционных сортировщик FACS, например, BD FACS AriaII, или помощь квалифицированного специалиста).
- Используя FACS сортировщик программного обеспечения (BD FACSDiva), подготовить соответствующие участки анализа для анализа рассеяния вперед (FSC), боковые рассеяния (SSC), 7AAD, FITC, PE и любого другого флуорофора использованы для маркировки клеток (рис. 2).
- Перед загрузкой каждого образца в ячейку сортировщик, вихрь кратко ресуспендирования клеток.
- Начните с анализа неокрашенных образцов для того, чтобы установить строб для всего населения клетке, из ворот челл мусора, а также для определения автофлуоресценции или фонового окрашивания.
- Анализ неокрашенных образцов + 7AAD, чтобы определить и ворота население живых клеток от общей популяции клеток.
- Анализ каждого отдельного управления цветом для определения и калибровки параметров, таких как компенсация.
- Анализ окрашенных образцов для определения положения ворот для сортировки.
- Как только параметры и ворота для желаемого популяции клеток были установлены, начинается сортировка меченых клеточных популяций в пробирки Эппендорф или 15 мл конические пробирки, содержащие культуральной среды или РНК буфера для лизиса (например, RLT буфера или Trizol).
Примечание: Если сортировки большого количества клеток, не рекомендуется для сортировки непосредственно в буфере для лизиса РНК, так как большой объем жидкости оболочка сопровождающие клетки разбавить буфером для лизиса и снижения урожайности.
- Побочные клетки вниз сразу же после сортировки закончен, и передача в свежую среду или РНК буфера для лизиса, де-в зависимости от цели вашего эксперимента.
- Если сортировка для того, чтобы культура изолированных клеток, выполняют стерильные рода. Для лучшего восстановления клеток, использование фенола красного бесплатно DMEM + 5% FCS, а FACS буфера II и сбор клеток в культуральной среде с 20% FCS.
- Если культивирование отсортированы фибробласты, коллаген alwaysplate на пластинках, покрытых и не непосредственно на пластик, так как это приводит к активации фибробластов, что приводит к изменениям в их экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование PDGFRα в качестве маркера для фибробластов приводит к изоляции высоко обогащенного популяции ткани фибробласты. Уровень чистоты после сортировки составила 99%, а количественно после сортировки анализа (рис. 2A). Оценивая процент загрязнения не-фибробластов в относительном выражении клеточных генов, специфичных для контроля (рис. 2В) обычно показывает 0.1-0.6% загрязнений. Этот уровень обеспечивает высокую чистоту профилирования транскриптом качество изолированной фибробластов 9.
В молочных железах, доля фибробластов в тканях колеблется в пределах 5-20% в нормальной ткани молочной железы, и 1-5% в MMTV-PyMT опухолей. Относительная доля фибробластов в опухолевой ткани ниже, чем в пре-опухолевой ткани, несмотря на увеличение общего числа фибробластов, в связи с массовым расширением эпителиальных отсека. Сокращенное% фибробластов, изолированных из опухолевой ткани является также результатомДобавлен технические трудности и снижение эффективности сортировки клеток с высокой некротических тканей.
Изолированные фибробласты могут быть выращены непосредственно после сортировки, но может потребоваться несколько дней, чтобы восстановиться (рис. 2D). Важно, чтобы выполнить все дальнейшие эксперименты с низким клетки проход, как первичные фибробласты подвергаются старению при распространении в культуре.
Рисунок 1. Очистка фибробласты из свежих молочных желез. A-FVB / п / PyMT мыши. B-Exposed молочных желез. C-Свежие молочные железы были вскрыты от FVB / п / PyMT мышей и переваривают коллагеназы к одной клеточной суспензии. Клетки иммунной меченные антитела для фибробластов поверхности маркер (PDGFRα) и маcrophages поверхности маркер (F4/80) с последующим разделением на FACS. Упорядочить фибробласты были либо культивировать или лизируются для очистки РНК. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Профилирование отсортированы фибробластов. -Single клеточные суспензии мыши молочных желез окрашивали PDGFRαand F4/80 антител. FACS сортировки сюжет показали (левая панель). Р2 фибробластов ворот (PDGFRα + клеток) и P4 является макрофаги ворот (F4/80 + клеток). Сообщение рода анализ был проведен для определения чистоты отсортированы фибробласты и макрофаги (средней и правой панелей). B-анализ сортировки чистоты QRT-PCR клеточных генов, специфичных для управления fibroblaST (PDGFRα, Col-1α), иммунных клетках (CD45, CSF-1R) и эпителиальные клетки (E-кадгерин). Результаты были нормированы на два дома учета генов (GAPDH и МГУС). Относительное выражение GAPDH показано. C-Количественное выражение PDGFRα в общей несортированные населения молочной фибробластов. D-культуры ткани отсортированных фибробластов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как эксперименты, проведенные в культуре тканей может быть информативным и функциональным предложить принципы, которые могут быть проверены в живом организме, как известно, большие изменения происходят в экспрессии генов клеток в культуре 11,12. Для того чтобы избежать шаг культуре тканей при профилировании экспрессии генов в фибробласты, мы разработали протокол, который позволяет изоляции нормальных, а также рака связанного фибробласты из свежей мыши или тканей человека. Этот протокол был успешно применен кожи, поджелудочной железы и ткани молочной железы от мыши и человека 9. Выделение фибробластов сортировки FACS требуется поверхностный маркер, что этикетки фибробластов. Мы установили, что PDGFRα является надежным маркером поверхности, что позволяет изоляции высоко обогащенного популяции фибробластов 9. Кроме того, PDGFRα выражается как на нормальные фибробласты ткани и на CAFS, что позволяет беспристрастные изоляции и профилей из ткани фибробласты, а не focusiнг на конкретную субпопуляции.
Фибробласты являются гетерогенной популяции клеток по отношению к экспрессии маркеров молекул, а также в их происхождении и свойствах сигнализации 8,10,18. В то время как PDGFRα является надежным маркером поверхности фибробластов, он не маркировать 100% фибробластов во всех тканях в результате немеченого субпопуляции клеток, в зависимости от типа ткани. В коже, примерно 90% фибробласты PDGFRα + (не показано), в то время как в молочных железах примерно 85% от общего числа фибробластов тканей PDGFRα + (рис. 2С). Процент PDGFRα выражения фибробласты могут отличаться в других типах тканей, и должна быть определена для каждой ткани. Тем не менее, в коже и в молочных железах, используя PDGFRα в качестве маркера клеточной поверхности может привести к высоко обогащенного популяции большинства тканей фибробластов, что позволяет профилирования экспрессии или культивирование отсортированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Ицхак Oschry и доктора Орит Sagi-Асиф за помощь в сортировке FACS. Это исследование было поддержано грантами на северо-восток от Европейского Союза Седьмой Рамочной Программы (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения N ° [276890], из Израиля Cancer Association (# 20110078), а из Израиля Cancer Research Fund (исследований Развитие карьеры Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
