新鲜组织分离正常和癌症相关的成纤维细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
Summary
癌相关成纤维细胞（CAFS）信号，促进细胞增殖，血管生成和炎症促进肿瘤的发生，生长和发展。在这里，我们描述了一种方法，分离出纯净的新鲜小鼠和人体组织的正常成纤维细胞和纤维母细胞分选，表面标志使用PDGFRα的人口。
Abstract
癌症相关的成纤维细胞（CAFS）是最重要的细胞类型，许多癌症的肿瘤间质内，特别是乳腺癌，其突出的存在往往与预后不良1,2。 CAF的活化的基质成纤维细胞的亚群，其中许多表达的肌纤维母细胞标记物α-SMA的3。 CAF的起源来自局部组织的成纤维细胞，以及从招募到显影的肿瘤和采用的CAF表型的影响下的肿瘤微环境4的骨髓来源的细胞。 CAF的信号，促进肿瘤细胞增殖，血管生成和侵袭5-8，促进肿瘤的发生，生长和发展。我们表明，CAF的提高肿瘤的生长，介导肿瘤促进炎症开始，最早在癌前阶段9。尽管越来越多的证据中发挥的关键作用CAF的促进肿瘤的生长，研究CAF的一直是一个持续的挑战，由于缺乏CAF-这些细胞的特异性标志物和广阔的异质性，与现有的许多亚型肿瘤微环境的10。此外，成纤维细胞的体外研究是通过阻碍它们的基因表达中的事实，常常在组织培养11,12改变。为了解决这个问题，让公正的新鲜小鼠的成纤维细胞和人体组织的基因表达分析，荧光激活细胞分选（FACS）13,14以前的协议的基础上，我们开发了一种方法。我们的方法依赖于利用PDGFRα隔离成纤维细胞的表面标记，从新鲜小鼠和人体组织。 PDGFRα中大量表达的正常成纤维细胞和纤维母9,15。此方法允许隔离纯种群的正常成纤维细胞和CAF的，包括，但不限于α-SMA +活化肌成纤维细胞。然后可以隔离成纤维细胞用于表征和比较基因的表达，在肿瘤发生在纤维母的演变。事实上，我们和其他人表达谱成纤维细胞分离细胞分选16。该协议成功地进行了高度浓缩的人群皮肤，乳腺，胰腺和肺组织中的成纤维细胞进行隔离和剖析。此外，我们的方法允许排序的细胞培养，在为了执行功能的实验，以避免污染的肿瘤细胞，这往往是一个很大的障碍时，试图来培养的CAF。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然在组织培养中进行的实验可以是信息性 的和建议可以验证在体内的功能原理，它是已知的，会发生大的变化，在基因表达的细胞在培养11,12。为了避免组织培养一步成纤维细胞中的基因表达分析时，我们开发了一个协议，允许隔离正常，以及与癌症相关的新鲜小鼠成纤维细胞或人体组织。该协议已成功应用于鼠标，从9人的皮肤，胰腺，乳腺组织。用流式细胞仪分?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢他们的帮助，流式细胞仪分选博士Yitzchak Oschry和博士ORIT的鹭阿西夫。这项研究得到了补助NE从欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）根据赠款协议Ň°[276890]，从以色列癌症协会（20110078），并从以色列癌症研究基金（ 研究职业发展奖 ）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
