Isolering af normale og cancer-associeret fibroblaster fra friske væv ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)
Summary
Cancer associeret Fibroblaster (CAFS) lette tumor initiering, vækst og progression gennem signalere, der fremmer spredning, angiogenese og inflammation. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere rene populationer af normale fibroblaster og CAFS fra frisk muse og humane væv ved cellesortering under anvendelse PDGFRα som overflademarkør.
Abstract
Cancerassocierede fibroblaster (CAFS) er de mest fremtrædende celletype i tumorstroma af mange cancere, især brystcancer, og deres fremtrædende tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig prognose 1,2. CAFS er en aktiveret subpopulation af stromale fibroblaster, hvoraf mange udtrykker myofibroblast markør α-SMA 3. CAFS stammer fra lokale væv fibroblaster såvel som fra knoglemarv-afledte celler rekrutteres til det udviklende tumor og vedtage en CAF fænotype under indflydelse af den tumormikromiljøet 4. CAFS blev vist at lette tumorinitiering, vækst og progression gennem signalering som fremmer tumorcelledeling, angiogenese og invasion 5-8. Vi viste, at CAFS forbedre tumorvækst ved at formidle tumor-fremmende inflammation, der starter tidligst præneoplastiske trin 9. Trods stigende tegn på den vigtige rolle, CAFS spille ved at lette tumor vækst,studere CAFS har været en løbende udfordring på grund af manglen på CAF-specifikke markører og det store forskellighed disse celler, med mange undertyper sameksisterende i tumormikromiljøet 10. Endvidere undersøger fibroblaster in vitro hindres af, at deres genekspression nu ofte ændres i vævskultur 11,12. For at løse dette problem og muliggøre uvildig genekspression profilering af fibroblaster fra frisk mus og humane væv, vi udviklet en metode baseret på tidligere protokoller for Fluorescence cellesortering (FACS) 13,14. Vores fremgangsmåde er baseret på anvendelse af PDGFRα som overflademarkør at isolere fibroblaster fra frisk muse-og humant væv. PDGFRα er rigeligt udtrykt ved både normale fibroblaster og CAFS 9,15. Denne fremgangsmåde tillader isolering af rene populationer af normale fibroblaster og cafeer, herunder, men ikke begrænset til α-SMA + aktiverede myofibroblaster. Isolerede fibroblaster kan derefteranvendes til karakterisering og sammenligning af udviklingen i genekspression, der opstår i CAFS under tumorigenese. Faktisk vi og andre rapporterede udtryk profilering af fibroblaster isoleret ved cellesortering 16. Denne protokol blev med succes udført for at isolere og profilere højt beriget populationer af fibroblaster fra hud, bryst, bugspytkirtel og lungevæv. Desuden er vores fremgangsmåde tillader også dyrkning af sorterede celler, for at udføre funktionelle forsøg og for at undgå forurening med tumorceller, hvilket ofte er en stor hindring, når de forsøger at dyrke CAFS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medens eksperimenter udført i vævskultur kan være informative og antyder funktionelle principper, der kan verificeres in vivo, er det kendt, at store ændringer i genekspression i celler i kultur 11,12. For at undgå en vævskultur trin ved profilering af genekspression i fibroblaster, har vi udviklet en protokol, der tillader isolering af normale, såvel som cancer-associerede fibroblaster fra friske mus eller humant væv. Denne protokol blev anvendt med succes med hud, pankreas og brystvæv fra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Yitzchak Oschry og Dr. Orit Sagi-Asif for deres hjælp med FACS sortering. Denne forskning blev støttet af tilskud til NE fra Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. [276.890], fra Israel Cancer Association (# 20.110.078), og fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
