Summary
Cancer associerade Fibroblaster (CAFS) underlätta tumörinitiering, tillväxt och progression genom signalering som främjar proliferation, angiogenes och inflammation. Här beskriver vi en metod för att isolera rena populationer av normala fibroblaster och CAFS från färsk mus och humana vävnader genom cellsortering med användning PDGFRα som en ytmarkör.
Abstract
Cancer-associerade fibroblaster (CAFS) är den mest framträdande celltypen i tumörstroma av många cancerformer, i synnerhet bröstcancer, och deras framträdande närvaro är ofta förknippad med dålig prognos 1,2. CAFS är en aktiverad subpopulation av stromala fibroblaster, av vilka många uttrycker myofibroblast markören α-SMA 3. CAFS härrör från lokala vävnad fibroblaster samt från benmärgshärledda celler rekryteras till utvecklingsländerna tumören och anta en CAF fenotyp under påverkan av tumören mikromiljön 4. CAFS visade att underlätta tumörinitiering, tillväxt och progression genom signalering som främjar tumörcellsproliferation, angiogenes och invasion 5-8. Vi visade att caféer ökar tumörtillväxt genom att förmedla tumör de främjar inflammation, med början tidigast preneoplastiska steg 9. Trots allt fler bevis på den nyckelroll caféer spela för att underlätta tumörtillväxt,studerar CAFS har varit en pågående utmaning på grund av bristen på CAF-specifika markörer och den stora heterogeniteten hos dessa celler, med många subtyper samexisterande i tumören mikromiljön 10. Dessutom studerar fibroblaster in vitro hindras av det faktum att deras genuttryck profil ofta förändras i vävnadsodling 11,12. För att lösa detta problem och för att möjliggöra opartiska profilering av genuttryck hos fibroblaster från frisk mus och mänskliga vävnader, utvecklade vi en metod som bygger på tidigare protokoll för fluorescens-cellsortering (FACS) 13,14. Vår strategi bygger på att utnyttja PDGFRα som en yta markör för att isolera fibroblaster från färsk mus och mänsklig vävnad. PDGFRα är rikligt uttrycks av både normala fibroblaster och CAFS 9,15. Denna metod medger isolering av rena populationer av normala fibroblaster och CAFS, inklusive, men inte begränsat till α-SMA + aktiverat myofibroblaster. Isolerade fibroblaster kan sedananvänds för karakterisering och jämförelse av utvecklingen av genuttryck som sker i caféer under tumörbildning. Faktum rapporterade vi och andra uttryck profilering av fibroblaster isolerade genom cellsortering 16. Detta protokoll framgångsrikt utförts för att isolera och profilera höganrikat populationer av fibroblaster från hud, bröst, bukspottkörtel och lungvävnad. Dessutom kan vår metod även odling av sorterade celler, för att utföra funktionella experiment och för att undvika kontaminering av tumörceller, vilket ofta är ett stort hinder när man försöker att odla CAFS.
Protocol
1. Dissekera Bröst eller hud vävnad från möss
- Innan dissekera önskad vävnad från möss, förbereda följande leveranser och reagenser:
Förbrukningsmaterial:
- Kirurgi verktyg (tvättas med diskmedel och sedan doppas i 70% etanol).
- Styrofoam yta att vila musen på under dissekering.
- Stift eller nålar för att hålla möss under dissektion.
- Glasburk med lock för matsmältningen, innehållande magnetisk omrörarstav (autoklaverad).
- Vattenbad vid 37 ° C, innehållande en dränkbar magnetisk omrörare och tillräckligt med vatten för att dränka matsmältningen burken, medan de vilar på omrörarplatta.
Reagens:
- FACS buffert I: (4 ° C): Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning CMF (Kalcium Magnesium Free) + 0,5% BSA
- Kollagenaslösning (gjord omedelbart före användning):
0,05 g Kollagenas II
0,05 g Kollagenas IV
0,01 g Deoxyribonuclease
20ml FACS buffert I. Håll kollagenaslösning på is tills användning. - PharmLyse (Ammoniumklorid lyserande reagens).
- FACS buffert II: Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning CMF + 1% FCS.
- Dissekering av bröstkörtlar (se även 17).
- Avliva honmöss med koldioxid (CO 2) inandning.
- På en frigolit yta, placera musen på rygg och stift fast alla fyra benen med 25 nålar (Figur 1A). Spraya musen generöst med 70% etanol.
- Använd pincett, dra upp bukhuden vid mittlinjen och gör ett litet snitt med vass sax.
- Med utgångspunkt från snittet, skära huden upp till halsen av djuret och samtidigt undvika punktering av buken eller bröstkorg håligheter.
- Skär huden på de bakre benen från mittlinjesnitt mot benet, vilket resulterar i en "Y-form".
- Dra huden från mus kropp och sätta fingret på, utsättamjölkkörtlar fäst vid undersidan av huden (Figur 1B).
- Använd Q-tips för att försiktigt separera mjölkkörtlar från huden samtidigt minska bindväv med små vassa sax för att separera bröstkörteln mot ryggraden av musen.
- Buken körtlar (# 4, 5) är bäst för detta protokoll. Du kan även använda två a bröstkörteln, men ha i åtanke att dessa körtlar anatomiskt är belägna i omedelbar närhet av pectoralis muskeln som kan vara svårt att separera, vilket resulterar i celler med blandad vävnad ursprung.
- Obs: När dissekera tumörvävnad, rekommenderas att ta bort nekrotiska områden.
- Dissektion av hudvävnad: Det enklaste sättet att få huden vävnad, utan att behöva ta itu med hårborttagning är att använda musen öron. Om en större mängd vävnad krävs, kan du raka av håret från mus torso och dissekera huden.
- Avliva möss med CO 2 inandning.
- Med hjälp av vassa sax, skära av båda öronen och omedelbart i matsmältningen burk som innehåller en liten mängd (~ 0,5 ml) av PBS på is.
2. Beredning av bröstkörtel / skinn enkelcellsuspension
- Placera mjölkkörtlar / hud i matsmältningen burk innehållande en liten volym PBS på is. Om vävnad är blodig tvätt x2 med PBS och sedan kasta överflödigt PBS.
- Finhacka noggrant med böjda sax.
- Tillsätt 20 ml kollagenas lösning (notera: denna mängd kollagenas lösning kommer effektivt dissocierar ungefär 5 g bröst eller tumörvävnad och öron från upp till 15 möss).
- Placera omedelbart rör plattan i 37 ° C vattenbad, och inkubera under 15 min under omröring vid medelhög hastighet.
Obs: optimala inkubationstider kan variera om smälta andra vävnader.
- För att stoppa reaktionen, tillsätt 30 ml kall DMEM + 10% FCS.
- Sila vävnaden / media blandning rakt igenomhektar 70 im cellfilter placerad ovanpå en 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera det koniska röret under 5 min vid 450 xg vid 4 ° C.
3. Röda blodkroppar Lysis
OBS: detta steg är inte nödvändigt om möss hjärt-perfusion med PBS innan de offrades.
- Aspirera supernatanten med hjälp av en glaspipett fäst vakuum, utan att störa cellpelleten.
- Att lysera RBC, resuspendera cellpelleten i 10 ml PharmLyse lösning och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Neutralisera PharmLyse lösningen genom att tillsätta ungefär 40 ml FACS-buffert I.
- Snurra koniskt rör med celler under 5 min vid 450 xg vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten.
4. Blockering av endogen Fc
- Tillval: Räkna celler för att bestämma lämplig volym för de följande stegen.
- Återsuspendera cellerna i 1-3 ml FACS buffert I (beroende ON mobilnummer och mängden antikroppar som du vill använda).
- Lägg FcBlock (anti-mus CD16/CD32) för att nå 1:50 utspädning (10 | ig / ml), och inkubera på is under 10-20 '.
Inget behov av att tvätta bort FcBlock.
5. Färgning
- Ta ut 100 | il alikvoter till eppendorfrör för att användas som en icke-färgade kontroll och enstaka kontroller färg (beroende på antalet fluorescerande antikroppar som användes).
- Att märka fibroblaster: lägg anti-PDGFRα (direkt konjugerade till fluorofor) en utspädning om 1:50 (10 ng / ml).
- Att märka andra cellpopulationer (t.ex. immunceller, makrofager, endotelceller etc.): lägg lämpliga fluorescens konjugerade antikroppar mot ytmarkörer, till en 1:50 utspädning.
OBS: Även PDGFRα är en robust markör för fibroblaster, rekommenderas att inkludera antikroppar för immunceller och epitelceller i syfte att utesluta dubbla positivabefolkningar och därmed förbättra renheten hos isolerade fibroblaster.
- Tillsätt 2 pl av varje antikropp till varje av de enskilda eppendorf färgkontroll rör.
- Inkubera cellerna med antikroppar under 1 timme på is i mörker.
- Att tvätta: fylla rören med FACS-buffert I och snurra under 5 min vid 450 xg vid 4 ° C.
- Sug supernatanten Återsuspendera cellerna i FACS buffert jag till en koncentration av ca 2 x 10 6 celler / ml, eller vilken koncentration som är lämpligast för sortering med tillgängliga FACS sorterare.
Valfritt: Celler kan återsuspenderas i FACS-buffert II för den tid av sortering. Detta kan förbättra cellviabilitet. Emellertid kan exponering för faktorer i serum har ett uttryck effekt genen, som bör testas, och beaktas.
- Överför märkta celler i FACS rör med filtertoppen: filter celler i rören för att förhindra cellklumpar.
- Att utesluta döda celler, tillsätt 7AAD (0,5 pg / ml) eller Propidium jodid (PI) till prover (utom för icke-färgade kontroll).
OBS: För att undvika slöseri celler kan du lägga till 7AAD/PI till FN-färgade prov efter inspelning i FACS, och använda igen som 7AAD endast kontroll.
- Håll prover på is medan analysera.
6. Isolering av celler genom FACS
(Obs! denna del av protokollet kräver förkunskaper i drift en FACS sorterare, t.ex. BD FACS AriaII eller hjälp av en skicklig tekniker).
- Använda FACS sorterare programvara (BD FACSDiva), förbereda lämpliga analys tomter för att analysera framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC), 7AAD, FITC, PE och alla andra fluorofor som används för att märka celler (Figur 2).
- Innan du laddar varje prov till cellen sorterare, skaka snabbt att återsuspendera cellerna.
- Börja med att analysera ofärgade provet för att ställa gating för den totala cellpopulationen, till gate ut celL skräp, och för att bestämma autofluorescens eller bakgrundsfärgning.
- Analysera ofärgade prov + 7AAD att bestämma och grind populationen av levande celler från den totala cellpopulationen.
- Analysera varje enskild färgkontroll att bestämma och kalibrera parametrar som kompensation.
- Analysera det färgade provet för att definiera positionen av grindar för sortering.
- När parametrar och grindar för de önskade cellpopulationerna har ställts in, börjar sortera märkta cellpopulationerna till eppendorfrör eller 15 ml koniska rör med odlingsmedium eller RNA lyseringsbuffert (t.ex. RLT buffert eller Trizol).
Obs: Om sortering av ett stort antal celler, rekommenderas det inte att sortera direkt i RNA lysbuffert, eftersom den stora volymen av omslutande vätska som åtföljer cellerna kommer att späda ut lysbuffert och minska utbytet.
- Spin celler ned omedelbart efter sortering är klar och överföring till färskt medium eller RNA lyseringsbuffert, deberoende på syftet med experimentet.
- Om sortering för att kultur isolerade celler, utföra steril sort. För bättre återhämtning av celler, använder fenolrött fritt DMEM + 5% FCS i stället för FACS buffert II och samla upp celler i odlingsmedium med 20% FCS.
- Om odling sorterade fibroblaster, alwaysplate på kollagen belagda plattor och aldrig direkt på plast som detta resulterar i aktivering av fibroblaster leder till förändringar i genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda PDGFRα som markör för fibroblaster resulterar i isolering av höganrikat populationer av vävnad fibroblaster. Nivån av renhet efter sortering var 99%, såsom kvantifierades genom efter-sort-analys (figur 2A). En beräkning av kontaminerande icke-fibroblastceller av det relativa uttrycket av cell-specifika gener kontroll (figur 2B) visar typiskt 0,1-0,6% förorening. Denna nivå av renhet tillåter hög profilering kvalitet transkriptom av isolerade fibroblaster 9.
I bröstkörtlar, varierar andelen fibroblaster i vävnaden mellan 5-20% i normal bröstvävnad, och 1-5% i MMTV-PyMT tumörer. Den relativa andelen av fibroblaster i tumörvävnad är lägre än i pre-neoplastisk vävnad, trots ökning av det totala antalet fibroblaster, på grund av den massiva utbyggnaden av den epiteliala facket. Den minskade% av fibroblaster isolerade från tumörvävnad är också ett resultat avdet tillsatta tekniska svårigheterna och minskad effektivitet av cellsortering från en mycket nekrotisk vävnad.
Isolerade fibroblaster kan odlas direkt efter sortering, men kan kräva ett par dagar att återhämta (figur 2D). Det är viktigt att utföra alla ytterligare experiment med låga passage celler som primära fibroblaster genomgår senescens under förökning i kultur.
Figur 1. Rening av fibroblaster från färska bröstkörtlar. A-FVB / N / PyMT mus. B-exponerad bröstkörtlarna. C-Färska bröstkörtlar dissekerades från FVB / N / PyMT möss och spjälkades med kollagenas till en enkelcellsuspension. Celler immun-märkta med antikroppar för fibroblast yta markör (PDGFRα) och macrophages yta markör (F4/80) följt av separation genom FACS. Sorterade fibroblaster antingen odlas eller lyseras för RNA rening. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Profilering av sorterade fibroblaster. A-Enkelcellsuspensioner av mus bröstkörtlarna färgades med PDGFRαand F4/80 antikroppar. FACS sortering tomt visas (vänstra panelen). P2 är fibroblaster grinden (PDGFRα + celler) och P4 är makrofager grinden (F4/80 + celler). En post sort analys utfördes för att bestämma renheten hos sorterade fibroblaster och makrofager (mitten och höger paneler). B-Analys av sortering renhet genom QRT-PCR av cellspecifika kontroll gener för fibroblast (PDGFRα, Col-1α), immunceller (CD45, CSF-1R) och epitelceller (E-cadherin). Resultaten normaliserades till två gener kammaren hålla (GAPDH och MGUS). Relativ uttryck för GAPDH visas. C-Kvantifiering av PDGFRα uttryck i den totala osorterade populationen av bröst fibroblaster. D-vävnadskultur av sorterade fibroblaster. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan experiment utförda i vävnadskultur kan vara informativ och föreslå funktionella principer som kan verifieras in vivo, är det känt att stora förändringar i genuttryck av celler i kultur 11,12. För att undvika ett steg vävnadsodling vid profilering av genuttryck i fibroblaster, utvecklade vi ett protokoll som gör det möjligt isolering av normala, liksom cancer-associerade fibroblaster från färsk mus eller mänsklig vävnad. Detta protokoll var framgångsrikt tillämpats med hud, bukspottkörtel och bröst vävnader från mus och från människa 9. Isolering av fibroblaster genom FACS sortering kräver en ytmarkör som etiketter fibroblaster. Vi konstaterade att PDGFRα är en robust yta markör som möjliggör isolering av höganrikat populationer av fibroblaster 9. Dessutom PDGFRα uttrycks på både normala vävnader fibroblaster och caféer, vilket möjliggör objektiv isolering och profilering av vävnad fibroblaster än focusing på en specifik underpopulation.
Fibroblaster är en heterogen cellpopulation med avseende på uttryck av markörmolekyler samt deras ursprung och signalering egenskaper 8,10,18. Medan PDGFRα är en robust yta markör för fibroblaster, inte märka att det inte 100% av fibroblaster i alla vävnader vilket resulterar i en omärkt subpopulation av celler, beroende på vävnadstyp. I huden, cirka 90% av fibroblaster är PDGFRα + (ej visad), medan i bröstkörtlar cirka 85% av den totala vävnad fibroblaster är PDGFRα + (Figur 2C). Den procentuella andelen PDGFRα uttrycker fibroblaster kan variera i andra vävnadstyper, och måste definieras för varje vävnad. Men i huden och i bröstkörtlarna, kommer att använda PDGFRα som cellytemarkör resultera i mycket anrikade populationer av de flesta vävnader fibroblaster, vilket expression profiling eller odling av sorterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Yitzchak Oschry och Dr Orit Sagi-Asif för deras hjälp med FACS sortering. Denna forskning har finansierats med bidrag till NE från Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr [276890] från Israel Cancer Association (# 20.110.078), och från Israel Cancer Research Fund (forskning Karriärutveckling utmärkelse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A.
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
