Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu
Summary
Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Kanser ile bağlantılı fibroblast (cafs) özellikle göğüs kanseri olmak üzere birçok kanser tümör stroma içinde en önemli hücre türüdürler ve bunların belirgin durum çoğu zaman zayıf prognoz 1,2 ile ilişkilidir. Cafs stromal fibroblastlann bir aktive alt gruptaki olup, bunların çoğu bu myo işaretleyici α-SMA 3 ifade eder. Cafs lokal doku fibroblast yanı sıra kemik iliği kökenli hücrelerin gelişen tümör içine alınmış ve tümör mikro 4 etkisi altında CAF fenotip kabul kaynaklanır. Cafs tümör hücre proliferasyonu, anjiyogenez ve işgali 5-8 teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyümesi ve ilerlemesi kolaylaştırmak için gösterildi. Bu cafs erken ön-neoplastik aşamaları 9 başlayarak, tümör terfili iltihap aracılık ederek tümör büyümesini artırmak olduğunu göstermiştir. Anahtar rol cafs rağmen artan kanıtlar, tümör büyümesini kolaylaştırmada oynamakokuyan cafs tümör mikro 10 co-mevcut pek çok alt tipi ile CAF-spesifik belirteçler ve bu hücrelerin büyük heterojenliğin eksikliği nedeniyle devam eden bir meydan olmuştur. Üstelik, in vitro olarak fibroblastlar okuyan bunların gen ekspresyonu profiline sıkça doku kültürü 11,12 değiştirildiği gerçeği ile engellenmektedir. Bu sorunu çözmek için ve taze fare ve insan dokularından fibroblastların tarafsız gen ekspresyon profili izin, biz Floresans-Aktif Hücre Ayırma (FACS) 13,14 için daha önceki protokollere dayalı bir yöntem geliştirdi. Bizim yaklaşımımız taze fare ve insan dokusundan fibroblastlar yalıtmak için bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak dayanır. PDGFRα bol, normal fibroblastlar ve cafs 9,15 ikisi tarafından ifade edilir. Bu yöntem de dahil olmak üzere, normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının, izolasyonu ancak α-SMA sınırlı sağlar + miyofibroblastlar aktif. İzole fibroblastlar sonra olabilirkarakterizasyonu ve tümörogenez boyunca cafs meydana gen ifadesinin evrim karşılaştırma için kullanılır. Nitekim, biz ve diğerleri 16 sıralama hücre izole fibroblastların ekspresyon profili bildirdi. Bu protokol başarıyla deri, meme, pankreas ve akciğer dokularından fibroblastların zenginleştirilmiş popülasyonları ayırmak ve profil yapıldı. Bunun yanı sıra, yöntem, aynı zamanda işlevsel deneyler için ve kültür cafs çalışırken sık sık büyük bir engel teşkil tümör hücreleri ile kirlenmesini önlemek üzere, sıralı hücrelerin kültürlenmesi izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doku kültüründe gerçekleştirilen deneyler bilgilendirici ve in vivo olarak kontrol edilebilir fonksiyonel ilkeler önermek mümkün olmakla birlikte, bu kültür içinde 11,12 hücrelerde gen ekspresyonunu büyük değişiklikler meydana geldiği bilinmektedir. Fibroblastlar gen ekspresyonu sırasında bir doku kültürü adım önlemek için amacıyla, sağlar taze fare veya insan dokusu normal hem de kanser-kaynaklı fibroblastlann izole edilmesi. Bir protokol gelişmiş Bu protokol başarıyl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz FACS sıralama ile yardım için Dr Yitzchak Oschry ve Dr Orit Sagi-Asif ederim. Bu araştırma hibe sözleşmesi n kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) NE hibe tarafından desteklenen ° [276.890], İsrail Kanser Derneği (# 20110078), gelen ve İsrail Kanser Araştırma Fonu (Research Kariyer Geliştirme Ödülü).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
